Анализ N-гликозилированного протеома в почках у мышей с моделью сахарного диабета

Введение

  • Диабетическая нефропатия (ДН) - позднее осложнениее сахарного диабета 1 (СД1) и 2 (СД2) типа.
  • Уже на ранних стадиях ДН обнаруживаются морфологические изменения на поверхности клеток и во внеклеточном матриксе - большинство белков подвергаются процессу N-гликозилирования.
    • Эти гликозилированные белки играют важную роль в клеточной адгезии и клеточно-матриксных процессах, но мало известно о том, каким изменениям они подвержены при ДН и может ли различная этиология СД1 и СД2 повлиять на их численность.
  • По мере прогрессирования ДН в почках и при СД1, и при СД2 протекают схожие структурные изменения - утолщение канальцевой и клубочковой базальной мембраны, внеклеточного матрикса и мезангиального пространства, а также изменения в структуре протеогликана на поверхности клеток и во внеклеточном пространстве.
    • Изменения в N-гликозилированном протеоме были неоднократно замечены при различных заболеваниях и в разных типах клеток.

Методы

  • N-гликозилированию был подвергнут протеом почек у db/db мышей (модели с ожирением, сахарным диабетом и дислипидемией), получавших инсулин или контрольный препарат, у мышей с стрептозотоцин-индуцированным СД (СТЗ) и у контрольной группы здоровых мышей.
  • Обе модели мышей имели ранние признаки ДН, проявляющиеся в повышенной экскреции альбумина вследствие гипергликемии.
  • Гликопептиды были подвергнуты анализу методом масс-спектрометрии и выделенные таким образом множества белков, обнаруженных в обеих моделях, сравнивались с помощью многомерного анализа.

Результаты

Экспериментальный дизайн и основные параметры

  • Мыши с СТЗ индуцированным СД достигли уровня гликемии 33,4±1,45 ммоль/л в крови спустя 10 недель после стимуляции развития СД по сравнению с довольно стабильным уровнем гликемии 6,06±1,28 ммоль/л в здоровой контрольной группе на протяжении всего исследования.
  • Вес у СТЗ мышей незначительно изменился и был приблизительно на 5 гр ниже, чем у контрольной группы в исходе исследования (25,3±1,2 против 30±0,5 гр).
  • Уровень экскреции альбумина был примерно в 10 раз выше у СТЗ мышей 578±117 мкг/24 ч в сравнении с 65,7±12,0 мкг/24 ч в контрольной здоровой группе.
  • db/db мыши не достигли того же уровня гипергликемии, максимальная цифра в их группе составила 23,12±2,5 ммоль/л относительно 8,91±0,28 ммоль/л в db/+ контрольной группе на 22 неделю эксперимента.
  • Несмотря на более низкий уровень гликемии у db/db мышей, уровень HbA1c% был примерно таким же или немного выше при заключительном сравнении с группой СТЗ мышей (8,52±0,7% против 7,60±0,13% соответственно).
  • В группе db/db мышей диабет был вторичен по отношению к перееданию и их вес достигал 54±3,2 против 31±0,8 гр на 16 неделе (db/db против db/+).
    • Затем их вес стабилизировался.
  • Экскреция альбумина увеличилась восьмикратно у db/db мышей (930,2 ± 184,8 мкг/24 ч 112,2 ± 54,5 мкг/24 ч у db/+).
  • У db/db мышей, получавших инсулин, уровень HbA1c% был немного выше по сравнению с исходным уровнем, чем у db/db мышей, получавших контрольный препарат, но спустя 12 недель (на 22 неделе исследования) уровень HbA1c% был снижен у первой группы (6,78±0,23%) по сравнению со второй (8,52±0,7%).
  • На 22 неделе не было значительного различия в экскреции альбумина и уровня глюкозы крови, но вес продолжал увеличиваться у db/db мышей, получавших инсулин и спустя 12 недель терапии составлял 62,3±0,9 гр в сравнении с 53,7±3,8 гр у db мышей, получавших контрольный препарат.

Сравнение СТЗ и db/db мышей при помощи многофакторного анализа

  • Сборка белка основывается на ранее N-гликозилированных пептидах, происходящих на основе 505 распознанных белков из 2602 ранее N-гликозилированных пептидов в группе СТЗ мышей и 395 белков из 3564 пептидов в группе db/db мышей.
  • 153 идентифицированных белка были определены как общие для обеих групп мышей.
  • Все белки в рамках своей группы были подвергнуты исследованию при помощи метода главных компонентов (МГК) и метода наименьших квадратов (МНК).

Обсуждение

  • В обеих группах наблюдалось повышение уровня HbA1c%, указывающее на наличие СД и альбуминурия (в сравнение с группой здоровых мышей) - ранний характерный признак ДН.
  • ДН является поздним осложнением, которое развивается лишь спустя десятилетия после постановки диагноза при СД1.
    • Поэтому отдельного внимания заслуживает то, что мыши имеют продолжительность жизни, достаточную для того, чтобы обнаружить повреждение почек на поздних стадиях, которые наблюдаются у человека с ДН.
  • При сравнении двух групп мышей было показано, что наибольшее число белков регулируется схожим образом.
  • Однако регуляция некоторых белков была обратной по отношению к другим в группах db/db, получавших контрольный препарат и СТЗ по сравнению с контрольной группой.
  • Наибольшее число внеклеточных, секретируемых и поверхностных клеточных белков подвергаются N-гликозилированию.
  • Количество трех основных канальцевых белков (SGLT1, PROM1 и ALPL) было снижено в модели СТЗ и повышено у db/db по сравнению с контрольной группой.
    • Натрий-глюкозный котранспортер (SGLT) необходим для реабсорбции глюкозы из первичной мочи в кровь, и разный профиль экспрессии SGLT1 в двух моделях указывает на то, что различия в количестве SGLT могут быть специфичными для того или иного типа СД.
    • В модели СТЗ, имеющей такие вторичные осложнения СД, как васкулопатия сетчатки и нейропатия, было показано, что в фоторецепторах PROM1 (ген, кодирующий проминин-1) разрушается под действием металлопротеазы-9 (ММР9).
    • Эти результаты могут свидетельствовать о том, что присутствие PROM1 может иметь влияние на снижение микроваскулярных повреждений при ретинопатии, так как отсутствие PROM1 ассоциировано с этой патологией.
      • Подобный эффект может иметь место в проксимальных канальцах у СТЗ мышей, где количество PROM1 снижалось по сравнению со здоровой группой.
  • Было показано, что инсулин оказывает явный эффект на некоторые почечные белки, главным образом в контрольной db/db группе.
  • Уровень клубочкового белка SIRPA уже имел пониженные показатели в db/db группе по сравнению со здоровой, а инсулин способствовал еще большему его снижению.
    • Этот белок взаимодействует с нефрином в щелевой диафрагме и может быть вовлечен в процесс повреждения подоцитов.
  • Инсулин также заметно снизил число GPR116 в группе db/db и отмечено, что в жировой ткани удаление Gpr116 может вызвать замедление прогрессирования толерантности к инсулину.

Заключение

  • Данное исследование, заключавшееся в N-гликозилировании белков протеомов экстрацеллюлярного матрикса и клеточной поверхности, показало, что существуют значительные различия в двух исследованных моделях СД.
  • Полученные данные позволяют предположить, что белковые различия в почках, специфичные для каждого вида СД, могут предшествовать общим морфологическим изменениям, происходящим на поздних стадиях ДН.
  • Показано, что инсулин влияет на на количиство N-гликозилированных белков в модели db/db.
  • Эти изменения могут быть связаны со cнижением уровня гипергликемии или другим системным эффектом, оказываемым инсулином.
  • Введение инсулина, жизненно необходимое при СД1 и имеющее альтернативу при лечении СД2, оказывает значительный эффект на N-гликозилированный протеом в группе db/db, что может вызвать интерес при сравнении со схемами терапии, применяемыми при СД2.

Источник:

  1. Liljedahl L, Pedersen MH, Norlin J, McGuire JN, James P. N-glycosylation proteome enrichment analysis in kidney reveals differences between diabetic mouse models. Clinical Proteomics. 2016;13:22. doi:10.1186/s12014-016-9123-z.
%d такие блоггеры, как: