Введение
- Диабетическая нефропатия (ДН) — позднее осложнениее сахарного диабета 1 (СД1) и 2 (СД2) типа.
- Уже на ранних стадиях ДН обнаруживаются морфологические изменения на поверхности клеток и во внеклеточном матриксе — большинство белков подвергаются процессу N-гликозилирования.
- Эти гликозилированные белки играют важную роль в клеточной адгезии и клеточно-матриксных процессах, но мало известно о том, каким изменениям они подвержены при ДН и может ли различная этиология СД1 и СД2 повлиять на их численность.
- По мере прогрессирования ДН в почках и при СД1, и при СД2 протекают схожие структурные изменения — утолщение канальцевой и клубочковой базальной мембраны, внеклеточного матрикса и мезангиального пространства, а также изменения в структуре протеогликана на поверхности клеток и во внеклеточном пространстве.
- Изменения в N-гликозилированном протеоме были неоднократно замечены при различных заболеваниях и в разных типах клеток.
Методы
- N-гликозилированию был подвергнут протеом почек у db/db мышей (модели с ожирением, сахарным диабетом и дислипидемией), получавших инсулин или контрольный препарат, у мышей с стрептозотоцин-индуцированным СД (СТЗ) и у контрольной группы здоровых мышей.
- Обе модели мышей имели ранние признаки ДН, проявляющиеся в повышенной экскреции альбумина вследствие гипергликемии.
- Гликопептиды были подвергнуты анализу методом масс-спектрометрии и выделенные таким образом множества белков, обнаруженных в обеих моделях, сравнивались с помощью многомерного анализа.
Результаты
Экспериментальный дизайн и основные параметры
- Мыши с СТЗ индуцированным СД достигли уровня гликемии 33,4±1,45 ммоль/л в крови спустя 10 недель после стимуляции развития СД по сравнению с довольно стабильным уровнем гликемии 6,06±1,28 ммоль/л в здоровой контрольной группе на протяжении всего исследования.
- Вес у СТЗ мышей незначительно изменился и был приблизительно на 5 гр ниже, чем у контрольной группы в исходе исследования (25,3±1,2 против 30±0,5 гр).
- Уровень экскреции альбумина был примерно в 10 раз выше у СТЗ мышей 578±117 мкг/24 ч в сравнении с 65,7±12,0 мкг/24 ч в контрольной здоровой группе.
- db/db мыши не достигли того же уровня гипергликемии, максимальная цифра в их группе составила 23,12±2,5 ммоль/л относительно 8,91±0,28 ммоль/л в db/+ контрольной группе на 22 неделю эксперимента.
- Несмотря на более низкий уровень гликемии у db/db мышей, уровень HbA1c% был примерно таким же или немного выше при заключительном сравнении с группой СТЗ мышей (8,52±0,7% против 7,60±0,13% соответственно).
- В группе db/db мышей диабет был вторичен по отношению к перееданию и их вес достигал 54±3,2 против 31±0,8 гр на 16 неделе (db/db против db/+).
- Затем их вес стабилизировался.
- Экскреция альбумина увеличилась восьмикратно у db/db мышей (930,2 ± 184,8 мкг/24 ч 112,2 ± 54,5 мкг/24 ч у db/+).
- У db/db мышей, получавших инсулин, уровень HbA1c% был немного выше по сравнению с исходным уровнем, чем у db/db мышей, получавших контрольный препарат, но спустя 12 недель (на 22 неделе исследования) уровень HbA1c% был снижен у первой группы (6,78±0,23%) по сравнению со второй (8,52±0,7%).
- На 22 неделе не было значительного различия в экскреции альбумина и уровня глюкозы крови, но вес продолжал увеличиваться у db/db мышей, получавших инсулин и спустя 12 недель терапии составлял 62,3±0,9 гр в сравнении с 53,7±3,8 гр у db мышей, получавших контрольный препарат.
Сравнение СТЗ и db/db мышей при помощи многофакторного анализа
- Сборка белка основывается на ранее N-гликозилированных пептидах, происходящих на основе 505 распознанных белков из 2602 ранее N-гликозилированных пептидов в группе СТЗ мышей и 395 белков из 3564 пептидов в группе db/db мышей.
- 153 идентифицированных белка были определены как общие для обеих групп мышей.
- Все белки в рамках своей группы были подвергнуты исследованию при помощи метода главных компонентов (МГК) и метода наименьших квадратов (МНК).
Обсуждение
- В обеих группах наблюдалось повышение уровня HbA1c%, указывающее на наличие СД и альбуминурия (в сравнение с группой здоровых мышей) — ранний характерный признак ДН.
- ДН является поздним осложнением, которое развивается лишь спустя десятилетия после постановки диагноза при СД1.
- Поэтому отдельного внимания заслуживает то, что мыши имеют продолжительность жизни, достаточную для того, чтобы обнаружить повреждение почек на поздних стадиях, которые наблюдаются у человека с ДН.
- При сравнении двух групп мышей было показано, что наибольшее число белков регулируется схожим образом.
- Однако регуляция некоторых белков была обратной по отношению к другим в группах db/db, получавших контрольный препарат и СТЗ по сравнению с контрольной группой.
- Наибольшее число внеклеточных, секретируемых и поверхностных клеточных белков подвергаются N-гликозилированию.
- Количество трех основных канальцевых белков (SGLT1, PROM1 и ALPL) было снижено в модели СТЗ и повышено у db/db по сравнению с контрольной группой.
- Натрий-глюкозный котранспортер (SGLT) необходим для реабсорбции глюкозы из первичной мочи в кровь, и разный профиль экспрессии SGLT1 в двух моделях указывает на то, что различия в количестве SGLT могут быть специфичными для того или иного типа СД.
- В модели СТЗ, имеющей такие вторичные осложнения СД, как васкулопатия сетчатки и нейропатия, было показано, что в фоторецепторах PROM1 (ген, кодирующий проминин-1) разрушается под действием металлопротеазы-9 (ММР9).
- Эти результаты могут свидетельствовать о том, что присутствие PROM1 может иметь влияние на снижение микроваскулярных повреждений при ретинопатии, так как отсутствие PROM1 ассоциировано с этой патологией.
- Подобный эффект может иметь место в проксимальных канальцах у СТЗ мышей, где количество PROM1 снижалось по сравнению со здоровой группой.
- Было показано, что инсулин оказывает явный эффект на некоторые почечные белки, главным образом в контрольной db/db группе.
- Уровень клубочкового белка SIRPA уже имел пониженные показатели в db/db группе по сравнению со здоровой, а инсулин способствовал еще большему его снижению.
- Этот белок взаимодействует с нефрином в щелевой диафрагме и может быть вовлечен в процесс повреждения подоцитов.
- Инсулин также заметно снизил число GPR116 в группе db/db и отмечено, что в жировой ткани удаление Gpr116 может вызвать замедление прогрессирования толерантности к инсулину.
Заключение
- Данное исследование, заключавшееся в N-гликозилировании белков протеомов экстрацеллюлярного матрикса и клеточной поверхности, показало, что существуют значительные различия в двух исследованных моделях СД.
- Полученные данные позволяют предположить, что белковые различия в почках, специфичные для каждого вида СД, могут предшествовать общим морфологическим изменениям, происходящим на поздних стадиях ДН.
- Показано, что инсулин влияет на на количиство N-гликозилированных белков в модели db/db.
- Эти изменения могут быть связаны со cнижением уровня гипергликемии или другим системным эффектом, оказываемым инсулином.
- Введение инсулина, жизненно необходимое при СД1 и имеющее альтернативу при лечении СД2, оказывает значительный эффект на N-гликозилированный протеом в группе db/db, что может вызвать интерес при сравнении со схемами терапии, применяемыми при СД2.
Источник:
- Liljedahl L, Pedersen MH, Norlin J, McGuire JN, James P. N-glycosylation proteome enrichment analysis in kidney reveals differences between diabetic mouse models. Clinical Proteomics. 2016;13:22. doi:10.1186/s12014-016-9123-z.