Анализ связей между фенотипом и генотипом при АКТГ-продуцирующей аденоме гипофиза

Введение

• Болезнь Кушинга (БК) — тяжелое эндокринное заболевание.
• 80-90% пациентов с этим заболеванием — женщины в возрасте 35-44 лет.
• Методом выбора лечения БК является транссфеноидальная аденомэктомия.
  • К сожалению, доля пациентов, которая не способна достичь ремиссии и доля случаев рецидива после транссфеноидальной аденомэктомии, остаются высокими.
• Исследования показали, что риск рецидива после операции сохраняется в течение 10 лет.
  • Примерно треть пациентов нуждается в дополнительной терапии, включающей в себя вторую операцию, лучевую терапию, билатеральную адреналэктомию и лекарственную терапию.
• Каждый метод имеет свои ограничения, поэтому крайне важно понимание молекулярных механизмов БК и изучение механизмов работы гормонов в гипофизе.

АКТГ-продуцирующая аденома гипофиза стимулирует избыточное образование кортизола корой надпочечников.

• Избыток гормонов оказывает влияние на обменные процессы с помощью различных механизмов, включающих в себя
  • перераспределение свободных жирных кислот,
  • их депонирование,
  • повышение процессов глюконеогенеза,
  • угнетение захвата глюкозы периферическими тканями,
  • ослабление эффектов инсулина.

Эти нарушения в свою очередь ведут к повышению риска кардио- и цереброваскулярных заболеваний.

• У 50%, 93% и 56% пациентов с БК развивается сахарный диабет, артериальная гипертензия и дислипидемия соответственно.

Избыток кортизола разрушает коллагеновый матрикс кости, нарушает синтез и усиливает разрушение костной ткани.

Результаты

Анализ зависимости клинических проявлений

• В рамках данного исследования в течении 14 месяцев было проведено 118 операций по транссфеноидальной резекции АКТГ-продуцирующих аденом.
• Проанализировав 106 клинических проявлений с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена, было получено, что между размером опухоли и такими показателями как уровень АКТГ, кортизола, лютеинизирующего гормона и эстрадиола существует прямая линейная связь, точно так же как и с параметрами минеральной плотности костной ткани (МПК).
• В то же время была получена слабая корреляционная связь с биохимическими показателями крови, характеризующими деятельность сердечно-сосудистой системы, функцию печени, почек, электролитный обмен, обмен жиров и углеводов.
• Диаметр АКТГ-продуцирующей аденомы позитивно коррелировал с уровнями АКТГ, сывороточного кортизола и кортизола в моче и обратно пропорционально коррелировал с параметрами плотности костной ткани (по Z-критерию).
  • Таким образом, размер опухоли коррелировал с пониженной плотностью костной ткани (по Z-критерию).

Профиль экспрессии гена при АКТГ-продуцирующих аденомах гипофиза

• Для изучения генотипических изменений в 9 парных АКТГ-продуцирующих аденомах гипофиза и прилегающей непораженной ткани гипофиза (ПНТГ) было использовано глубокое секвенирование РНК.
• С помощью анализа функционального обогащения генов было изучено 423 избирательно экспрессированных генов.
• Для иллюстрации генной онтологии была использована программа Cytoscape.
• Было получено, что каждый узел представляет собой набор генов, а самое интересное, что наиболее значительно экспрессированные гены были распределены на 5 групп:
  • группа онкогенеза,
  • ангиогенеза,
  • группы, ответственные за развитие гипофиза,
  • за секрецию гормонов,
  • метаболизм костной ткани.
• Эти результаты довольно хорошо соответствовали наблюдаемым клиническим фенотипическим изменениям.

Из 423 избирательно экспрессированных генов было выделено 138 генов, ответственных за параметры минеральной плотности кости.

• Функционирование 40 из них описаны уже давно и ответственны они за повреждение костной ткани и за опухоль;
• Еще 39 генов ответственны только за повреждение костной ткани, в то время как 8 генов отвечает только за саму опухоль.
• В целом 79 из 138 генов ответственны за повреждение костной ткани, а оставшиеся 51 неосвещенных генов могут быть ответственны за принципиально новые механизмы, запускающие остеопороз при АКТГ-продуцирующей аденоме гипофиза.
• Впоследствии для построения сетевой модели между этими 138 генами была использована база данных белок-белковых взаимодействий.
• Только 78 белковых взаимодействий было извлечено из этой базы и поэтому именно они были отобраны позднее.
  • Примечательно, что 48 из этих 78 генов (визуализация при помощи PPI cytoscape) образовывали одну сетевую модель, в то время как остальные 30 были не связаны.
• Это означает, что эта сеть, сформированная из 48 экспрессированных генов АКТГ-продуцирующей аденомы, может впоследствии раскрыть молекулярные механизмы остеопороза у больных БК.

Молекулярные связи при остеопорозе

• Из этих 48 генов в свою очередь было отобрано 5 генов — SPP1, COL1A1, NT5E, HTRA1 и ANGPT1 — кодирующие именно те белки, которые секретируются гипофизом и изучили их экспрессию в опухолевых клетках у 118 пациентов с БК при помощи ПЦР в режиме реального времени, а затем провели количественный анализ.
• Было получено, что экспрессия этих пяти генов в АКТГ-продуцирующей аденоме значительно отличалась от их экспрессии в ПНТГ, что может играть огромную роль в развитии остеопороза у пациентов с БК.

Согласно Белковой базе данных эти пять генов в свою очередь отвечают за синтез пяти белков.

• Повышенное количество белков SPP1, COL1A1 и NT5E, которые, как предполагается, секретируются аденомой гипофиза, напрямую воздействуют на опорно-двигательную систему, что приводит впоследствии к остеопорозу, в то время как снижение количества NT5E и HTRA1 разрушает структуру кости и процессы ее развития. 
• Предыдущие исследования показали, что RANKL (лиганд рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В), MCSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор) и TGF β (трансформирующий фактора роста β) играют решающую роль в развитии остепороза.
• В дальнейшем определена роль этих пяти белковых молекул и их сигнальных путей в разрушении костной ткани.
• SPP1, также всем известный как остеопонтин, взаимодействуя с интегриновыми рецепторами, активирует путь NIK-IKK-NF-kB.
  • В конечном итоге это приводит к присоединению остеокластов на поверхности кости в процессе костной резорбции.
• COL1A1, опять же взаимодействуя с интегриновыми рецепторами, усиливает путь GRB2-RAS-RAF-MEK-ERK.
  • Мутация этого гена приводит к развитию незавершенного остеогенеза и развитию идиопатического остеопороза.
• NT5E катализирует аденозинмонофосфат до аденозина, который  оказывает влияние на остеогенную дифференцировку.
• Все эти пути раскрывают молекулярную связь между аденомой гипофиза и остеопорозом, они могут напрямую или опосредованно нарушать процессы остеобластогенеза, ухудшать функцию остеобластов, усиливать их апоптоз.

Обсуждение

• Остеопороз очень распространенная проблема, хоть она часто и недооценивается у пациентов с БК.
• Предыдущие исследования показали, что мутация глюкокортикоидного рецептора или дефицит гена могут стать причиной развития стероидной резистентности, что в свою очередь ведет к повышению секреции кортизола.
• Кортизол же играет ключевую роль в регуляции обмена костной ткани на многих уровнях.

Анализ клинических проявлений у 118 пациентов показал, что размер опухоли и уровень гормона АКТГ коррелируют с показателями плотности костной ткани.

• Самое интересное, что клинические проявления метаболического синдрома или патологии сердца, которые в основном и наблюдаются у больных БК, не так сильно коррелируют с размером опухоли.

Генотипический анализ подтвердил, что опухоль, гормоны и метаболизм кости в целом связаны с транскриптомными изменениями.

• Анализ связей между фенотипом и генотипом показал наличие группы генов, отвечающих за плотность костной ткани у пациентов с БК.

Выбрано 5 генов и кодируемых ими белков для осуществления экспериментов в опухолевой ткани и в прилегающей непораженной ткани гипофиза и в дальнейшем проанализированы их сигнальные пути для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе развития остеопороза у пациентов с БК.

• Молекулярные механизмы NT5E, ANGPT1 и HTRA1 всё еще до конца не изучены, но сигнальные пути, которые они активируют, очень тесно связаны с путями, отвечающими за строение и развитие костной ткани.

Таким образом, возникновение и развитие остеопороза у пациентов БК — довольно сложный процесс, который связан не только с повышенной секрецией кортизола, но и с процессами регуляции генов, ответственных за развитие данной патологии.

Материалы и методы

• Протокол был одобрен Этическим Комитетом Больницы при Пекинском Объединенном Медицинской Колледже (045-2011, 1 сентября, 2011, Пекин, Китай).
• Для изучения с кафедры нейрохирургии было получено 118 свежих препаратов АКТГ-продуцирующих аденом в промежутках между 16 мая 2012 года по 25 июля 2013 года.

Было получено:

• 38 препаратов АКТГ-продуцирующих аденом и ПНТГ получено от женщин;
• 52 препарата АКТГ-продуцирующих аденом и ПНТГ получено от мужчин;
• также было приобретено 13 независимых АКТГ-продуцирующих аденом и 4 образца ПНТГ от мужчин.

Для достижения постоперационной эндокринной ремиссии были проведены селективные аденомэктомии с полным удалением микроаденомы и соответствующей резекцией прилегающих тканей.

Критерии исключения у групп с ПНТГ:

• возраст ≤19 лет;
• беременность;
• опухоль гипофиза окружена псевдокапсулой таким образом, чтобы опухоль была целиком удалена вдоль псевдокапсулы;
• микроаденома, соотношение остаток/нормальная ткань ≤1/3 всего гипофиза после операции.

Критерии включения:

• состоящие в браке, имеющие ребенка/детей, отсутствие беременности;
• тяжелые симптомы и проявления БК;
• микроаденома, размер опухоли на МРТ≤5мм;
• нормальное функционирование гипофиза при предоперационном наблюдении и обследовании.

Фрагменты тканей были немедленно заморожены в жидком азоте в условиях рибонуклеазы на время операции и хранили при 80°С до тех пор, пока не произошла изоляция РНК.

• Все образцы были повторно обследованы двумя патологоанатомами, которые выявили, что процент опухолевых клеток в образцах АКТГ-продуцирующих аденом составлял 80% и более.
• В нормальных тканях опухолевых клеток обнаружено не было.
• Никто из пациентов перед резекцией не получал лучевую или химиотерапию.

Плотность костной ткани была измерена в передне-задней проекции в поясничном отделе позвоночника (L1-L4) и в правой бедренной кости при помощи двойной энергетической рентгеновской абсорциометрии.

• Остеопения определялась при плотности костной ткани от -1 до -2,5 SD (стандартного отклонения); остеопороз определялся при плотности костной ткани поясничного отдела позвоночника или правой бедреной кости, когда показатель был ниже, чем -2,5.

Рандомно отобрано 9 парных опухолей гипофиза и ПНТГ от 38 парных образцов для определения профилей генной экспрессии при помощи РНК-секвенирования.

• Был загружен геном и транскриптом эталонных последовательностей с сайта UCSC.
• Считывания, которые однозначно могут быть сопоставлены с геном, были использованы для расчета уровня экспрессии.
• Дифференциальный индекс (ДИ) был введен для выявления дифференциально экспрессирующихся генов среди 9 парных выборок на следующие процессы:
  • во-первых, кратное изменение образцов каждой пары было приведено к значениям 0-1; 1 считается самое существенное различие, 0 – отсутствие различий между двумя парными образцами,
  • во-вторых, ДИ девяти парных образцов сводился к значениям в среднем 0-1. ДИ рассчитывался по специальной формуле.

423 дифференциально экспрессированных гена были функционально сгруппированы при помощи он-лайн метода генного обогащения David.

• Генная онтология десяти функциональных групп была отфильтрована на основе значения р˃0,05 и FDR˃0,1 и в последующем описано при помощи программного обеспечения Cytoscape.

Целая РНК была изолирована при помощи Тризола в соответствии с протоколом производителя.

• Качество и количество РНК оценивали с помощью NanoDrop2000.
• Комплиментарная ДНК была синтезирована с 1 мкг целой РНК при помощи High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
• qRT-PCR (обратная транскрипция-полимеразная реакция в режиме реального времени) была выполнена при помощи LightCycler 480 SYBR Green Master в соответствии с инструкциями производителя.
• Сигналы были получены с использованием the Roche LC480 Real-Time PCR System.
• Относительный уровень экспрессии определяли при помощи ∆∆Сt method и доведен  до уровней GAPDH.

Для изучения экспрессии белков в АКТГ-продуцирующих аденомах гипофиза после изоляции РНК белки были преципитированы из фенол-этаноловой надосадочной жидкости.

• Равные количества белка были разделены при помощи SDS-полиакрилаимдного геля, затем их переносили на нитроцеллюлозную мембрану  и инкубировали в  растворе (TBS буфер, содержащий 5% обезжиренного сухого молока) в течение 1 часа при комнатной температуре.
• Затем мембраны были инкубированы на протяжении ночи при температуре 4° с первичными антителами (anti-SPP1, epitomic #2671-1, 1:500; anti-COL1A1, epitomic, #6690-1,1:500; anti-NT5E, epitomic, #5362-1, 1:1000; anti-HTRA1, Abcam, ab38611, 1:200; anti-ANGPT1, Abcam, ab8451, 1:200; anti-GAPDH:1:2000, epitomic, #5632-1), а затем с HRP-конъюгированными вторичными антителами на 1 час при комнатной температуре.
• Иммунные комплексы визуализировались при помощи электрохемилюминесценции (ECL Western Blotting Detection Reagents) и проявлены пленкой Кодак.

Статистический анализ.

• Использовался 1 образец по ранговому критерию Вилкоксона для обнаружения различий клинических параметров между пациентами с опухолью гипофиза и здоровыми людьми.
• Использовался U-test Манна-Уитни в измерениях показателей и тест хи-квадрат при подсчете показателей для выявления различий в клинических параметрах между двумя различными группами пациентов с опухолями гипофиза.
• Использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмана среди 9 или 109 фено-фенотипов для вычисления корреляции и коэффициент корреляции Пирсона  среди 9 фено-генотипов для корреляционного изучения.
• Метод Бенджамини-Хохберга был использован для контроля ожидаемой доли ложных отклонений.
• Критерий знаковых рангов Вилкоксона был использован для обнаружения различий в мРНК и уровней экспрессии белка между парными образцами у пациентов с опухолями гипофиза, в то время как U-тест Манна-Уитни был использован для обнаружения уровней экспрессии гена между двумя непарными образцами.
• Критерий знаковых рангов Вилкоксона, U-тест Манна-Уитни и анализы статистической корреляции были проведены с SPSS16·0 for Windows.
• Многократная оценка коррекции значений ожидаемой доли ложных отклонений была рассчитана с использованием Software R scrpt.
• Значения p менее 0,05, полученные от двустороннего теста всех анализов, считались статистически значимыми.

Заключение

Полученные результаты дают новое понимание потенциальных механизмов развития остеопороза при АКТГ-продуцирующих аденомах гипофиза, тем самым открывая новые потенциальные возможности для борьбы с ним.

Источник:

1. Wang R, Yang Y, Sheng M, et al. Phenotype-Genotype Association Analysis of ACTH-Secreting Pituitary Adenoma and Its Molecular Link to Patient Osteoporosis. Xian CJ, ed. International Journal of Molecular Sciences. 2016;17(10):1654. doi:10.3390/ijms17101654.