Лекарственная устойчивость аденом гипофиза к аналогам дофамина и соматостатина: роль цитоскелета в её формировании

By Екатерина Кудряшова|Февраль 15, 2016|Новости, Новости науки|0 comments

  • Причина возникновения опухолей гипофиза – избыточная пролиферация гипофизарных клеток определённого подтипа.
  • Большая часть опухолей гипофиза — доброкачественные.
  • Тем не менее, они могут являться причиной серьёзных осложнений:
    • зрительных нарушений
    • неврологической симптоматики (вследствие масс-эффекта)
    • эндокринологических синдромов (возникают как следствие гормональной гиперсекреции).
  • Основной терапевтической мишенью при опухолях гипофиза являются рецепторы к дофамину (DA) DRD2 и к соматостатину (SS) SSTRs, так как:
    • Воздействие на них тормозит секрецию обоих гормонов и опухолевую пролиферацию.
    • В большинстве случаев экспрессия рецепторов к этим гормонам сохраняется.
  • Аналоги дофамина и соматостатина длительного действия в настоящее время используются соответственно для лечения
    • пролактин-продуцирующих
    • соматотропин-продуцирующих аденом гипофиза.
  • Данные о частоте положительных эффектов, полученных в результате лечения этими препаратами, различаются по исследованиям.
  • На сегодняшний день молекулярная основа лекарственной устойчивости остаётся недостаточно изученной.
  • Предполагаемые механизмы резистентности:
    • нарушение экспрессии DRD2 и SSTRs
    • генетический дефект DRD2 и SSTRs
    • нарушение в системе передачи сигнала.
  • В ходе недавних исследований установлена взаимосвязь между
    • экспрессией рецепторов DRD2 и SSTRs и
    • передачей сигналов по сигнальным путям.
  • Выявлена корреляция между экспрессией филамина А (FLNA) и восприимчивостью опухолей гипофиза к фармакотерапии.
  • В настоящем обзоре освещаются известные молекулярные механизмы устойчивости к SS и DA. Особое внимание уделяется роли филамина А.

Введение

  • Опухоли гипофиза, как правило, доброкачественные.
  • Их распространённость среди всех внутричерепных новообразований составляет 10- 25%.
  • Могут являться причиной:
    • выпадения полей зрения
    • появления неврологической симптоматики (вследствие масс-эффекта)
    • эндокринологических синдромов (как результат гиперпродукции гормонов)
    • знаков и симптомов, специфичных для определённого подтипа клеток, подвергшихся злокачественной трансформации.
  • Пролактинома — самая частая функционирующая аденома гипофиза.
    • у женщин:
      • аменореей,
      • бесплодием,
      • патологической галактореей;
    • у мужчин:
      • эректильной дисфункцией,
      • бесплодием.
    • Клинически проявляется:
  • Избыточная секреция гормона роста опухолевыми соматотропными клетками — причина гигантизма у детей и акромегалии у взрослых.
    • Высокая смертность при этом связана с осложнениями со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем, а также с метаболическими нарушениями.
  • АКТГ — продуцирующая аденома гипофиза является патогенетической основой формирования болезни Кушинга (гиперкортицизм).
  • Клиническая картина при тиреотропиноме обусловлена эффектами гиперпродукции тиреотропина.
  • Нефункциональные объёмные образования гипофиза (NFPAs) являются гормонально-неактивными; нередким проявлением служит неврологическая симптоматика (вследствие масс-эффекта).
  • Объёмные образования гипофиза часто сохраняют восприимчивость к гипофизотропным факторам, таким как:
    • дофамин (DA)
    • соматостатин (SS)
    • пептиды, физиологически ингибирующие гормональную секрецию и клеточную пролиферацию на центральном и периферическом уровнях (считается, что они обладают терапевтическим потенциалом).
  • DA тормозит синтез и секрецию пролактина, взаимодействуя со специфичными рецепторами подтипа 2 (DRD2). Комплекс «гормон- рецептор» присоединяется к гетеротримерным белкам Gi и G0, что в последствии приводит к инактивации аденилатциклазы и закрытию кальциевых каналов.
    • DRD2 оказывает антипролиферативные эффекты, регулируя активность сигнального пути ERK.
    • В результате альтернативного сплайсинга образуются 2 изоформы этого рецептора: D2S (короткий) и D2L (длинный), содержащий 29 остатков аминокислот в 3 внутриклеточной петле.

Агонисты DRD2 являются терапией первой линии при пролактиномах. Каберголин — наиболее эффективный и хорошо переносимый препарат из данной группы.

  • Они позволяют успешно контролировать:
    • клинические симптомы
    • уровень пролактина
    • размер опухоли.
  • Используются с целью уменьшения объёма вмешательства при АКТГ- продуцирующих и гормонально-неактивных объёмных образованиях гипофиза.

Соматостатин связывается с группой рецепторов, сопряжённых с G-белком (SSTR1-5)

  •  2 и 5 подтипы, как правило, с высокой плотностью экспрессируются при соматотропиномах.
  • Через сопряжение с разными PTX-чувствительными G-белками, SSTRs инактивирует аденилатциклазу.
  • Воздействие на некоторые подтипы SSTRs приводит к уменьшению поступления Ca в клетку путём инактивирования специфических каналов L- типа и Ca — зависимых калиевых каналов.
    • Описанный механизм, в числе прочих, обеспечивает торможение гормональной секреции.
  • Как SSTR2, так и SSTR5 реализуют антипролиферативные эффекты соматостатина через соответственно:
    • активацию тирозинфосфатазы,
    • угнетение фосфорилирования ERK 1/2.
  • Через активацию SSTR2 и SST3 обеспечиваются эффекты апоптоза.
  • В настоящее время аналоги соматостатина (SS) (препараты длительного действия, например, октреотид и ланреотид) используются в лечении объёмных образований гипофиза (в частности соматотропином и тиротропином).

Молекулярные механизмы лекарственной резистентности объёмных образований гипофиза

  • Вопреки доказанному тормозящему влиянию аналогов DA и SS на клеточную пролиферацию и гормональную секрецию существует категория пациентов (10% пациентов с пролактиномой и 30 % пациентов с акромегалией):
    • устойчивых к терапии карберголином и октреоитидом, соответственно.
  • Большинство пациентов с нефункциональными и АКТГ-продуцирующими объёмными образованиями гипофиза нечувствительны к действию обоих препаратов.
  • Лекарственная устойчивость пролактином – это неспособность:
    • поддерживать нормальный уровень пролактина
    • добиться 50%-го уменьшения размера опухоли.
  • Лекарственная устойчивость к аналогам SS у пациентов с акромегалией определяется отсутствие:
    • биохимической ремиссии ( нормальный уровень IGF1, при случайном исследовании уровень ГР < 1 мг/ л и пороговый уровень СТГ после проведения ОГТТ < 0,4 мг/ л)
    • уменьшения размера опухоли ( < 20% от изначального объёма).
  • показатель смертности
  • показатель летальности
  • качество жизни.
  • Фармакологическая резистентность аденом гипофиза может существенно влиять на:
  • Устойчивость пролактином к каберголину ассоциирована с
    • инвазивностью,
    • большей агрессивностью,
    • увеличением риска развития карциномы.
  • В ходе исследований последних лет были изучены различные нарушения молекулярного уровня, наличие которых может объяснить разный ответ на терапию препаратами-аналогами DA и SS.
    • К ним относятся:
      • нарушения экспрессии DRD2 и SSTRs,
      • генетические дефекты DRD2 и SSTRs,
      • нарушения в системе сигнальных путей,
      • вовлечённость белков цитоскелета.
  • Многие аспекты проблемы лекарственной устойчивости нуждаются в дальнейшем комлексном рассмотрении.

Снижение экспрессии SSTRs и DRD2 клетками “устойчивых” объёмных образований

  • Как правило, сниженная экспрессия рецепторов DA и SS на мембранах клеток аденомы гипофиза ассоциирована со слабым ответом на терапию.
  • В частности, в отношении пролактином было доказано, что на DA-резистентных аденомах плотность рецепторов DRD2 была ниже по сравнению с DA- чувствительными объёмными образованиями.
    • Аналогично, в первом случае, отмечалась меньшая экспрессия специфических изоформ DRD2, D2S или D2L.
  • В большей степени остаётся спорным вопрос о наличии корреляции между устойчивостью к SS и уменьшением экспрессии SSTRs.
    • Согласно имеющимся данным, с одной стороны, некоторые соматотропиномы устойчивы к терапии несмотря на высокий уровень экспрессии SSTR2;
    • С другой стороны, описана корреляция между подавлением секреции ГР, уменьшением опухолевой массы под действием аналогов SS, и SSTR2 мРНК и уровнем белка.
  • Как бы там ни было, молекулярные механизмы, лежащие в основе снижения эксрессии DRD2 и SSTRs, остаются малопонятными.
  • При изучении нарушений в генетическом аппарате и посттрансляционных механизмов учёные пришли к выводу, что ключевая роль в белок-опосредованной регуляции принадлежит цитоскелету.

Генетические дефекты SSTRs и DRD2

  • В исследованиях, посвящённых изучению генетических дефектов SSTRs и DRD2, описано, что

    • мутации в экзонах и/или утрата гетерогенности в локусах, где расположены соответствующие гены, встречаются крайне редко.
  • В частности, при изучении 79 пациентов с пролактиномами не было обнаружено ни 1 мутации в гене DRD2.
  • В ходе секвенирования экзома у пациентов с бромокриптин-устойчивыми и бромокриптин-чувствительными пролактиномами генетических различий в экзоне, кодирующем синтез DRD2, обнаружено не было.
  • При генотипировании порядка 200 пациентов с пролактиномами и контрольной группы с целью выявления обычного полиморфизма гена DRD2, было установлено, что:
    • устойчивость к DA коррелирует только с обычным полиморфизмом;
    • замещение цитозина на тимин в 957 локусе коррелирует с подверженностью мигрени и шизофрении. Это также может повлиять на фолдинг мРНК, снизив её стабильность и трансляцию.
  • Так же, как и в случае с DRD2, у пациентов с лекарственной устойчивостью мутации в генах, отвечающих за синтез SSTR2 и SSTR5, обычно отсутствуют.
  • Единственная мутация SSTR, описанная на сегодняшний день,- R240W, герминативная мутация в гене SSTR5, обнаруженная у пациента с акромегалией и лекарственной устойчивостью к октреотиду.

  • Данная миссенс- мутация расположена в 3ей внутриклеточной петле SST5, области, критической в отношении сопряжения G-протеинов.
  • В ходе исследований установлено, что взаимодействие с мутантным R240W рецептором не приводит к торможению секреции СТГ, а также клеточной пролиферации, под действием агонистов SSTR5.
  • R240W рецептор сохраняет способность к снижению уровня внутриклеточного цАМФ в результате неспособности сопрягаться с GоА- белком, но не с другими G-протеинами (Gi1 , i2, i3 и GоВ), активируемыми взаимодействием с немутантными типами SSTR5.
  • Считается, что полиморфные варианты гена SSTR2 не играют роли в формировании лекарственной устойчивости соматотропином к SS.
  • 2 замещённых нуклеотида в промоторной последовательности гена SSTR2 в 83 и 57 позициях основного инициального сайта транскрипции не приводят к возникновению различий в клинических характеристиках, гормональном профиле или чувствительности к SS.
  • В ходе изучения гена SSTR5 был обнаружен его однонуклеотидный полиморфизм.
  • Т- аллель rs34037914 определяет предрасположенность к:
    • устойчивости к антипролиферативным эффектам SS
    • увеличению агрессивности новообразования
    • послеоперационным рецидивам аденом гипофиза.
  • Тем не менее, утрата гетерозиготности геном SSTR5, расположенном в 16p13.3 хромосоме, – редкое явление, встречающееся при опухолях гипофиза приблизительно в 10% случаев.
  • Кроме того, в сохранном аллеле отсутствовали мутации при соматотропиноме с утратой гетерозиготности в локусе SSTR5.
  • Потеря гетерозиготности при это не сопровождалась формированием лекарственной устойчивости к октреотиду.
  • В заключение, была обнаружена корреляция между экспрессией укороченного варианта SSTR5 (SST5TMD4), предположительно, имеющего внутриклеточную локализацию, но при этом способного к передачи сигналов и:
    • снижением способности октреоида к нормализации гормональной секреции при опухолях со слабым ответом на терапию;
    • агрессивными чертами новообразования, включая устойчивость к SS и способность к инвазии.
  • Высокий уровень SST5TMD4 коррелирует со слабым ответом на терапию аналогами SS,
    • даже при условии высокой экспрессии SSTR2, обусловливающей доминантно-негативный эффект этой укороченной изоформы SSTR5 на SSTR2- ассоциированный сигнальный путь.

Пострецепторные нарушения

  • Помимо нарушений на уровне рецепторов SS и DA, формирование лекарственной устойчивости аденом гипофиза может быть связано с дефектами в системе сигнальных путей.
  • В пользу гипотезы «пострецепторных нарушений» как возможного механизма устойчивости к аналогам SS говорит диссоциация между:
    • антисекреторными и антипролиферативными эффектами аналогов SS в условиях организма у некоторых пациентов с акромегалией
    • результатами лабораторных экспериментов на опухолевых соматотропных клетках, в которых аналоги SS оказывают антипролиферативные эффекты без угнетения секреции ГР.
  • Стимуляция SSTRs через образование связи этих рецепторов с различными представителями семейства Gi-белков приводит к угнетению гормональной секреции и клеточной пролиферации.
  • Несмотря на то, что низкая экспрессия Gi1-3 — белков зафиксирована при СТГ-продуцирующих объёмных образованиях, анализ возможной корреляции с устойчивостью к аналогам SS не проводился.
  • Нарушение подобной связи, или дефект нижележащего эффектора может вызвать недостаточную активацию специфического сигнального пути без затрагивания других сигнальных каскадов.
  • В этой связи, установлено, что активация SSTR5 приводит к реализации соматотропными клетками антипролиферативных и антисекреторных эффектов через ассоциацию с белком-ингибитором GoA, независимо от снижения цАМФ. Таким образом, обеспечивается разобщённость между разными сигнальными путями.
  • Появились данные о возможной роли дефектов G-белков в формировании лекарственной устойчивости к аналогам DA и SS.
  • Снижение экспрессии Gi2-белка (не G0 и Gs) описано при каберголин-резистентных пролактиномах.
  • А- субъединица G-белка-активатора заслуживает отдельного внимания. Соматические активирующие мутации в гене, кодирующем его синтез (GNAS, также известный как gsp– онкоген), обнаруживаются в 30-40% при соматотропиномах.
  • Стоит заметить, что gsp– положительные новообразования характеризуются возрастающей чувствительностью к терапии аналогами SS. Это свойство, на сегодняшний день, остаётся необъяснённым, так как увеличения плотности SS рецепторов при этом не отмечается.
  • Нарушения в сигнальной трансдукции SSTRs могут являться причиной классической октреотид-резистентности, которая наблюдается у пациентов с акромегалией.
  • Передача сигнала может быть нарушена вследствие:
    • герминативной мутации в гене, кодирующем синтез арил-гидрокарбонового белка-рецептора (AIP);
    • низкой экспрессии AIP, даже при отсутствии мутаций.
  • AIP-опухолевый супрессорный ген. Доказано, что его активация приводит к уменьшению опухолевой массы посредством ZAC1.
    • Более того, выключение AIP приводит к активации опухолевой прогрессии в гипофизе через дефектный Gi- белок.
    • Интересно заметить, что низкая экспрессия AIP не ассоциирована с резистентностью к пасиреотиду, аналогу SS, характеризующимся высоким афиннитетом к SSTR5. Это означает, что AIP не участвует в сигнальной трансдукции данного специфического подтипа SSTR.
    • Генетический анализ AIP проводился у 50 пациентов с акромегалией без семейного анамнеза этого заболевания и с лекарственной устойчивостью к аналогам SS.
    • В ходе него была установлена невысокая, но заметная распространённость герминативных мутаций супрессорного гена у этих больных.
  • Таким образом, частично прояснилась роль его дефекта в резистентности к SS при спорадических соматотропиномах.
    • Fougner и соавторами была установлена корреляция между экспрессией ингибитора Raf- киназы (RKIP) и чувствительностью СТГ- продуцирующей аденомы к аналогам SS.
    • RKIP регулирует активность Raf1- киназы и, как следствие, – сигнального пути MAPK, обеспечивающего антипролиферативные эффекты SS,- а также блокирует G-белок-ассоциированный рецептор киназы2. Последний, возможно, влияет на интернализацию и деградацию SSTRs.
  • Помимо активации сопряжённых G- протеинов, GPCRs воздействует непосредственно на их внутриклеточные петли через цитоплазматические и поверхностные белки, участвующие в:
    • стабилизации GPCRs
    • их десенсибилизации
    • интернализации
    • сигнальной трансдукции.
  • К этим белкам относятся б-аррестины 1 и 2 (каркасные протеины), обеспечивающие десенсибилизацию и сигнальную трансдукцию нескольких GPCRs (включая SSTRs и DRD2).
  • Низкая экспрессия б-аррестина 1 при соматотропиномах и пролактиномах коррелирует со снижением скорости диссоциации комплекса лиганд-SSTR2 и лучшим ответом на терапию (проявляющимся подавлением секреции СТГ) как в условиях in vitro, так и in vivo.
  • О нарушении сигнальной трансдукции DRD2 как о возможном механизме лекарственной устойчивости известно значительно меньше.
  • В ходе исследований установлено, что сигнальный путь TGF-b/ Smad, через который отчасти реализуются антипролиферативные эффекты DA:
  • не функционирует при DA-устойчивых аденомах гипофиза;
  • действует в аденогипофизе здоровых людей.
  • При секвенировании экзома 6 бромокриптин-резистентных и 6 бромокриптин-чувствительных пролактином определили:
    • генетические варианты DRD2 гена
    • 10 генов, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости (например, PRB3 и PRDM2).
  • Экспрессия этих генов в случае аденом, устойчивых к лечению, была ниже. Механизм, объясняющий это явление, на сегодняшний день не изучен.
  • Наконец, в ходе недавних исследований установили, что специфический профиль экспрессии микроРНК ассоциирован с бромокриптин-резистентностью пролактином.
  • Среди дифференциально экспрессируемых микроРНК, mir93 непосредственно снижает экспрессию p21 в MMQ клетках через воздействие на 3′-нетранслируемую область.

Принципиально новый механизм формирования лекарственной устойчивости аденом гипофиза: роль цитоскелета

  • В недавнем прошлом учёные выяснили, что цитоскелет участвует в сложных механизмах формирования лекарственной устойчивости аденом гипофиза к аналогам DA и SS.
  • Цитоскелет играет ключевую роль в процессах:
    • поддержания формы клетки
    • миграции клеток и их адгезии
    • клеточном делении
    • стабилизации положения цитоплазматических органелл
    • движении;
    •  внеклеточной сигнальной трансдукции
    • регуляции активности нескольких рецепторов.
  • К основным структурным компонентам цитоскелета относятся:
    • микротрубочки
    • промежуточные филаменты
    • микрофиламенты, возникающие в результате полимеризации различных мономеров.
  • Такие полимеры:
    • характеризуются структурными и функциональными различиями
    • подвергаются непрерывному обновлению и перестройке
    • способны особым образом связываться с различными семействами белков- партнёров.
  • Микрофиламенты:
    • наиболее тонкие среди филаментов
    • участвуют в поддержании формы клетки и её подвижности
    • состоят из актиновых нитей (F- актин), возникающих в результате полимеризации мономерного глобулярного актина (G- актина).
  • Многие семейства актин-связывающих белков, участвующие в формировании актин-связывающего домена, регулируют процессы полимеризации/ деполимеризации, а также объединяют F- актин в пучки и сети.
  • Среди них, филамины (FLN) являются актин-стабилизирующими белками. Они способны к формированию сетей из взаимно перпендикулярных актиновых филаментов, а также, будучи каркасными протеинами, – к связыванию различных белков-партнёров.

Филамин А: структура и функции

  • Семейство филаминов состоит из 3 гомологичных белков с высокой молекулярной массой:
    • филамина А (FLNA)
    • филамина В (FLNB)
    • филамина С (FLNC).
  • Синтез этих белков кодируется различными генами, расположенными в хромосомах Х, 3 и 7, соответственно.
  • 3 вышеперечисленные изоформы филамина у млекопитающих характеризуются высокой степенью гомологичности кодирующих последовательностей и высокой стабильностью геномной организации.

 

  • Человеческий FLNA , кодируемый Xq28:
    • первый актин-стабилизирующий белок, обнаруженный не в клетках мышечной ткани;
    • наиболее распространённая изоформа филамина среди взрослой популяции.
  • FLNA и FLNB экспрессируются повсеместно, в то время как FLNC — только в скелетных и сердечной мышцах.
    • В ходе нескольких исследований было доказано, что филамины необходимы для нормального развития человеческого организма
    • Более того, мутации в соответствующих генах приводят к формированию пороков развития мозга, костей и сердца с возможными летальными последствиями.
  • FLNA способен связывать множество других белков- партёров, включая:
    • некоторые GPCRs
    • интегрины
    • ионные каналы, обеспечивая их фиксацию к актину цитоскелета;
    • внутриклеточные сигнальные молекулы
    • киназы
    • факторы транскрипции ( все вышеперечисленные молекулы участвуют в сигнальной трансдукции).
    • трансмембранные:
  • Основная функция FLNA — стабилизация структуры трёхмерной F-актиновой сети (однако, функции FLNA не исчерпываются структурной).
  • В частности, в результате мутации в гене, кодирующем FLNA, развиваются:
    • перивентрикулярная (узелковая) гетеротопия
    • пороки развития головного мозга вследствие аномальной миграции нейронов (при которой группа нейронов теряет способность перемещаться в развивающуюся кору головного мозга)
    •  широкий спектр врождённых пороков (ухо-нёбно-пальцевой синдром, фронтометафизиарная дисплазия, остеодисплазия Мелника- Нидлса).
  • Все эти взаимодействия регулируются путём:
    • фосфорилировния FLNA
    • протеолиза
    • механических усилий
    • конкуренции
    • мультимеризации белков- партнёров.
  • Множество функций FLNA возможны благодаря уникальной структуре молекулы.
    • Каждый мономер имеет актин-связывающий домен (ABD) на N- конце, состоящий, в свою очередь, из 2 кальпонин-гомологичных доменов, за которыми следуют 24 иммуноглобулин-подобных повтора ( состоящих приблизительно из 96 аминокислотных остатков).
      • 2 кальпаин- чувствительные шарнирные области (H1 и H2) разделяют 24 повтора в rod-1 домене (повторы 1-15), rod- 2 домене (16-23) и 24 повтор.
    • Второй ABD с более низким аффинитетом расположен в rod-1, в то время как rod-2 вовлечён во взаимодействие с белками-партнёрами.
      • 24 повтор — самоассоцированный домен, который обеспечивает гомодимеризацию FLNA. При этом образуются V-образные гибкие структуры, что приводит к перпендикулярной сшивке актиновых филаментов.
    • Многообразие внутри семейства филаминов обеспечивается засчёт альтернативного сплайсинга их мРНК.
    • Используются альтернативные поли- (А)сигналы. В некоторых случаях происходят делеции в отдельных доменах.
    • В частности, в ходе предшествующих исследований была выявлена последовательность из 8 аминокислот в 15 повторе FLNA, а также внутренняя делеция 41 аминокислоты между 19 и 20 повторами (остатки 2127 — 2167), что соответствует варианту-1 FLNA, который широко экспрессируется на низком уровне.
    • FLNA состоит из 2 субъединиц, каждая массой 280 килодальтон.

Вклад FLNA в формирование устойчивости пролактином к агонистам DRD2

  • Впервые взаимодействие FLNA с DRD2 было продемонстрировано Lee и соавторами при проведении дрожжевого двугибридного скрининга и анализе белок-белкового взаимодействия.
    • Примечательно, что связывание с FLNA увеличивало эффективность сопряжения DRD2 с аденилатциклазой, а также играло роль в организации поверхностных рецепторов клетки.
  • Почти одновременно, в ходе другого исследования (в котором 3 внутриклеточная петля DRD2 использовалась в качестве затравки при проведении двугибридного анализа с целью скрининга библиотеки кДНК головного мозга) подтвердилась специфическая DRD2/FLNAассоциация.
  • Таким образом, функции специфических участков FLNA (повтор 19) и DRD2 (аминокислоты 211- 241 на N- конце 3 интрацеллюлярной петли) были изучены более пристально.
    • FLNA и DRD2 совместно располагались в клетках полосатого тела крыс.
    • Авторы установили, что DRD2 локализуется преимущественно внутриклеточно в М2, клеточной линии меланомы человека, не экспрессирующей FLNA.
    • Тогда как FLNA располагается на плазматической мембане A7 клеток, той же линии, прочно трансфицированной с FLNA.
    • Отсюда можно заключить, что FLNA нуждается в поверхностном расположении DRD2 что показано на примере использования доминантно-негативной укороченной формы FLNA (повторы 18-19, содержащие в себе DRD2, но не актин-связывающий домен).
  • Схожие эффекты FLNA в регуляции DRD2 обнаружены при пролактиномах.
    • Сначала было установлено снижение DRD2 при DA-резистентных аденомах (что прежде связывали с лекарственной устойчивостью), сопровождается низкой экспрессией FLNA.
    • В ходе лабораторных исследований, начавшихся с этого экспериментального наблюдения, доказали, что нарушение на уровне FLNA в виде выключения генов или сверхэкспрессии в первичной культуре клеток пролактиномы приводит к соответствующим изменениям DRD2.
    • Кроме того, снижение выделения пролактина и фосфорилирование ERK 1/ 2, ассоциированные с применением DRD2 агонистов, нарушаются после выключения гена FLNA.
    • В то же время, DA- резистентные пролактиномы, экспресссия FLNA при которых недостаточна, восстанавливают чувствительность к терапии после трансфекции с FLNA.
  • Опыты, проведённые на MMQ клетках крыс, клеточной модели пролактиномы, участвующей в эндогенной экспрессии функциональных DRD2 и FLNA, показали, что FLNA:
    • необходим для взаимодействия с DRD2 клеточной мембраны
    • препятствует лизосомальной деградации DRD2.
    • регулирует жизненный цикл DRD2, вызывая либо его перестройку, либо лизосомальную деградацию.
  • FLNA непосредственно взаимодействует с б-аррестинами, участвующими в перемещении DRD2,- из чего можно заключить, что стабильность DRD2 регулируется комплексом рецептор-FLNA-аррестин.
  • Приведённые выше данные говорят в пользу наличия у FLNA протективной функции в отношении стабильности рецепторов.
  • Помимо DRD2 речь также идёт о:
    • кальций-чувствительном рецепторе
    • кальцитониновом рецепторе
    • муковисцидозном трансмембранном регуляторе проводимости
    • высокоафинном рецепторе IgG Fc-гамма-RI.
  • Кроме структурной функции, заключающейся в фиксации DRD2 к актину цитоскелета и регулировании положения рецептора и его стабильности, FLNA также принимает участие в передаче сигнала по сигнальному пути.
  • В гипофизе предусмотрен значительный резерв DRD2 для угнетения секреции пролактина: плато достигается при загруженности рецепторов на 40% (в гипофизарных клетках крысы).
  • 60% уменьшение количества DRD2, измеренное в пролактиномах и MMQ -клетках после снижения FLNA, может являться не единственной причиной утраты влияния DRD2 на секрецию пролактина, а также на клеточную пролиферацию.
  • FLNA играет ключевую роль как в выраженности экспрессии DRD2, так и в функционировании сигнальных каскадов в лактотрофных клетках. В связи с этим, дефицит FLNA может расцениваться как один из механизмов формирования резистентности к DA, ранее отмечавшейся при пролактиномах.
  • Для прояснения молекулярных механизмов формирования резистентности аденом гипофиза, связанной со снижением экспрессии FLNA , потребуется проведение новых исследований.
  • На сегодняшний день в CpG-островке гена FLNA, области, которая с высокой долей вероятности регулирует функции молекулы, не обнаружено мутаций за исключением эпигенетического сайлесинга.

Роль FLNA в регуляции экспрессии SSTR2 и передаче сигналов по сигнальному пути при СТГ-продуцирующих аденомах

  • Считается, что помимо DRD2, FLNA также играет ключевую роль в регуляции экспрессии SSTR2 и, таким образом, оказывает существенное влияние на чувствительность к терапии SS у пациентов с акромегалией.
  • Прямое взаимодействие FLNA с SSTR2 впервые было продемонстрировано при помощи поверхностного плазмонного резонанса.
  • Контакт возникает между первой внтуриклеточной петлёй SSTR2 и повторами 19-20 FLNA. Благодаря этому взаимодействию положение SSTR2 в клеточной мембране стабильно.
  • Против того, что было замечено в отношении DRD2, SSTR2, в свою очередь, правильно ориентирован в плазматической мембране M2-клеток, не экспрессирующих FLNA. Однако, после стимуляции агонистом SSTR2 скорость интернализации в М2 клетках возрастает по отношению к A7.
  • Авторы исследования также установили, что при помощи FLNA реализуется программа апоптоза. Молекулярный механизм заключается в конкурентном взаимодействии между FLNA и p85, регуляторной субъединицей PI3K (фосфоинозитид-3-киназы), в результате которого происходит прямое связывание с SSTR2.
  • Связывание FLNA с соответствующим лигандом приводит к разрушению комплекса SSTR2-p85 и последующему угнетению PI3K.
  • В ходе недавних исследований изучалось регулирующее влияние FLNA на SSTR2 у пациентов с соматотропиномами.
  • В отличие от экспрессии DRD2 при пролактиномах, экспрессия FLNA при СТГ-продуцирующих объёмных образованиях гипофиза не коррелирует с плотностью SSTR2, а выключение гена FLNA в человеческих опухолевых клетках не влияет на экспрессию SSTR2 и их стабильность относительно мембраны.
  • Между тем, через использование различных доминантно-негативных мутантных вариантов FLNA, у которых избирательно была угнетена способность к взаимодействию с SST2 (FLNA повторы 19-20) или функция «каркаса» для белков- партнёров (FLNA 21-24), было доказано, что роль FLNA складывается из 2 компонентов:
    • структурного (стабилизация экспрессии SST2 вследствие пролонгированной стимуляции специфическим агонистом)
    • функционального ( участвует в реализации сигнального пути).
  • Используя в качестве модели GH3-клетки крысы, продуцирующие СТГ, авторы исследования продемонстрировали, что стабильность комплекса FLNA/SSTR2 после пролонгированной стимуляции агонистами нарушается.
  • Возможно, это объясняется влиянием FLNA на лизосомальную деградацию SSTR2, так как даун-регуляция, вызванная связыванием SSTR2 с лигандом устраняется в случае её [лизосомальной деградации] предотвращения.
  • Также в рамках исследования оценивалось влияние FLNA на процесс интернализации SSTR2.
  • В ходе лабораторных экспериментов на соматотрофах получены данные о том, что FLNA необходим для SSTR2-опосредованного снижения активации циклина D1 и каспазы 3/7. Таким образом, FLNA играет ключевую роль в обеспечении антипролиферативного и проапоптозного эффектов SSTR2.
  • Было сделано наблюдение, что повторы FLNA 21-24, не препятствующие взаимодействию SSTR2 с эндогенным FLNA, могут помешать реализации программы апоптоза SST2. Также, зная об SSTR2-индуцированном торможении ERK1/ 2, можно утверждать, что карскасные свойства FLNA необходимы для сборки сигнальных комплексов.
  • Полученная в данном исследовании информация проясняет роль FLNA в формировании реакции на терапию аналогами SS при соматотропиномах.
  • Низкая экспрессия FLNA, приводящая к потере сообщения SSTR2 с нижележащими молекулами сигнального пути, может объяснить лекарственную резистентность соматотропином к аналогам SS, даже при условии достаточной экспрессии SSTR2.
  • Интересно, что в сплайс-варианте-1 FLNA, экспрессия которого на низком уровне обнаруживается повсеместно, не достаёт 41 аминокислоты между 19 и 20 повторами — области, которая отвечает за связывание и с DRD2, и с SST2.
  • По результатам проведения ЯМР- спектроскопии установлено, что в сплайс-варианте 19 повтор развёртывается в соответствии со своей природой, реализуя биологический эффект.
  • Сплайс-вариант FLNA в большей степени способен к связыванию с интегринами по сравнению с диким типом белка. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что альтернативный сплайсинг может выступать в качестве регуляторного механизма связывания FLNA с белками-партнёрами, а также влиять на чувствительность аденом гипофиза к терапии аналогами SS/ DA.

Возможное влияние FLNA на агрессивность и инвазивные свойства аденом гипофиза

  • Помимо регуляции GPCR, FLNA участвует в обеспечении подвижности клетки. FLNA вызывает ограниченное выбухание мембраны мигрирующих клеток, играя роль каркаса для белков, обеспечивающих перемещение и адгезию клеток.
  • Наблюдение, что при перевентрикулярной гетеротопии полное выключение гена FLNA вызывает нарушение миграции нейронов в кору больших полушарий , в купе с эспериментальными данными, полученными при исследовании FLNA-недостаточных M2 клеток, не способных к передвижению, означают, что FLNA принадежит ключевая роль в миграции клеток.
  • В противовес этому, было доказано, что гиперэкспрессия FLNA угнетает клеточную подвижность. В этом случае FLNA препятствует перемещению клеток, их инвазии и метастазированию.
  • Таким образом, можно заключить, что положительное или отрицательное влияние FLNA на подвижность клеток определяется их типом и уровнем экспрессии данного белка.
  • Большая часть объёмных образований гипофиза- доброкачественные опухоли, однако часто имеется локальная инвазия, которая в значительной степени ухудшает прогноз нейрохирургического лечения.
  • В связи с тем, что DA-резистентность пролактином ассоциирована с увеличением агрессивности этих опухолей и их способностью к инвазии, а снижение уровня FLNA коррелирует с устойчивостью к дофаминэргическим препаратам, можно предположить, что низкая экспрессия FLNA может быть причиной инвазивного роста опухоли.
  • До сих пор в литературе отсутствуют данные о влиянии экспрессии FLNA на клеточные миграцию и инвазию.
  • Потребуется проведение дальнейших исследований для того, чтобы оценить вклад нарушений уровня FLNA в клеточные инвазию и агрессивность, а также рецидивы опухолей гипофиза.

Заключение

  • Молекулярные механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости объёмных образований гипофиза к аналогам DA и SS, могут действовать на разных уровнях, начиная с активации рецептора агонистом до уровня реализации конечного биологического ответа в виде подавления гормональной секреции и уменьшения размера опухоли.
  • В отсутствии дефекта SSTR2, SSTR5 и DRD2 генов были обнаружены нарушения в молекулах, задействованных в передаче сигналов по пути, специфичному для этого рецептора, а также участвующих в регуляции экспрессии белков-рецепторов.
  • Появляется всё больше данных в пользу того, что экспрессия DRD2, SSTR2, локализация и реализация сигнальной трансдукции регулируются взаимодействием со структурным белком цитоскелета FLNA. Это в очередной раз подчёркивает множественность функций цитоскелета в физиологии клетки.
  • Будущие исследования будут направлены на изучение генетических и посттрансляционных модификаций, влияющих на экспрессию и функции FLNA. Это поможет прояснить сложные механизмы формирования лекарственной устойчивости при аденомах гипофиза.

 

Источник:

  1. Peverelli E, Treppiedi D, Giardino E, Vitali E, Lania AG, Mantovani G. Dopamine and Somatostatin Analogues Resistance of Pituitary Tumors: Focus on Cytoskeleton Involvement. Front Endocrinol (Lausanne). 2015;6:187.doi:10.3389/frendo.2015.00187.

 

Поделиться

Leave a Comment