Лекарственная устойчивость аденом гипофиза к аналогам дофамина и соматостатина: роль цитоскелета в её формировании

• Причина возникновения опухолей гипофиза — избыточная пролиферация гипофизарных клеток определённого подтипа.
• Большая часть опухолей гипофиза — доброкачественные.
• Тем не менее, они могут являться причиной серьёзных осложнений:
  • зрительных нарушений
  • неврологической симптоматики (вследствие масс-эффекта)
  • эндокринологических синдромов (возникают как следствие гормональной гиперсекреции).

• Основной терапевтической мишенью при опухолях гипофиза являются рецепторы к дофамину (DA) DRD2 и к соматостатину (SS) SSTRs, так как:
  • Воздействие на них тормозит секрецию обоих гормонов и опухолевую пролиферацию.
  • В большинстве случаев экспрессия рецепторов к этим гормонам сохраняется.

• Аналоги дофамина и соматостатина длительного действия в настоящее время используются соответственно для лечения
  • пролактин-продуцирующих
  • соматотропин-продуцирующих аденом гипофиза.
• Данные о частоте положительных эффектов, полученных в результате лечения этими препаратами, различаются по исследованиям.
• На сегодняшний день молекулярная основа лекарственной устойчивости остаётся недостаточно изученной.
• Предполагаемые механизмы резистентности:
  • нарушение экспрессии DRD2 и SSTRs
  • генетический дефект DRD2 и SSTRs
  • нарушение в системе передачи сигнала.
• В ходе недавних исследований установлена взаимосвязь между
  • экспрессией рецепторов DRD2 и SSTRs и
  • передачей сигналов по сигнальным путям.
• Выявлена корреляция между экспрессией филамина А (FLNA) и восприимчивостью опухолей гипофиза к фармакотерапии.
• В настоящем обзоре освещаются известные молекулярные механизмы устойчивости к SS и DA. Особое внимание уделяется роли филамина А.

Введение

• Опухоли гипофиза, как правило, доброкачественные.
• Их распространённость среди всех внутричерепных новообразований составляет 10- 25%.
• Могут являться причиной:
  • выпадения полей зрения
  • появления неврологической симптоматики (вследствие масс-эффекта)
  • эндокринологических синдромов (как результат гиперпродукции гормонов)
  • знаков и симптомов, специфичных для определённого подтипа клеток, подвергшихся злокачественной трансформации.
• Пролактинома — самая частая функционирующая аденома гипофиза.
  • у женщин:
    • аменореей,
    • бесплодием,
    • патологической галактореей;
  • у мужчин:
    • эректильной дисфункцией,
    • бесплодием.
  • Клинически проявляется:
• Избыточная секреция гормона роста опухолевыми соматотропными клетками — причина гигантизма у детей и акромегалии у взрослых.
  • Высокая смертность при этом связана с осложнениями со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем, а также с метаболическими нарушениями.
• АКТГ — продуцирующая аденома гипофиза является патогенетической основой формирования болезни Кушинга (гиперкортицизм).
• Клиническая картина при тиреотропиноме обусловлена эффектами гиперпродукции тиреотропина.
• Нефункциональные объёмные образования гипофиза (NFPAs) являются гормонально-неактивными; нередким проявлением служит неврологическая симптоматика (вследствие масс-эффекта).

• Объёмные образования гипофиза часто сохраняют восприимчивость к гипофизотропным факторам, таким как:
  • дофамин (DA)
  • соматостатин (SS)
  • пептиды, физиологически ингибирующие гормональную секрецию и клеточную пролиферацию на центральном и периферическом уровнях (считается, что они обладают терапевтическим потенциалом).
• DA тормозит синтез и секрецию пролактина, взаимодействуя со специфичными рецепторами подтипа 2 (DRD2). Комплекс «гормон- рецептор» присоединяется к гетеротримерным белкам Gi и G0, что в последствии приводит к инактивации аденилатциклазы и закрытию кальциевых каналов.
  • DRD2 оказывает антипролиферативные эффекты, регулируя активность сигнального пути ERK.
  • В результате альтернативного сплайсинга образуются 2 изоформы этого рецептора: D2S (короткий) и D2L (длинный), содержащий 29 остатков аминокислот в 3 внутриклеточной петле.

Агонисты DRD2 являются терапией первой линии при пролактиномах. Каберголин — наиболее эффективный и хорошо переносимый препарат из данной группы.

• Они позволяют успешно контролировать:
  • клинические симптомы
  • уровень пролактина
  • размер опухоли.
• Используются с целью уменьшения объёма вмешательства при АКТГ- продуцирующих и гормонально-неактивных объёмных образованиях гипофиза.

Соматостатин связывается с группой рецепторов, сопряжённых с G-белком (SSTR1-5)

•  2 и 5 подтипы, как правило, с высокой плотностью экспрессируются при соматотропиномах.
• Через сопряжение с разными PTX-чувствительными G-белками, SSTRs инактивирует аденилатциклазу.
• Воздействие на некоторые подтипы SSTRs приводит к уменьшению поступления Ca в клетку путём инактивирования специфических каналов L- типа и Ca — зависимых калиевых каналов.
  • Описанный механизм, в числе прочих, обеспечивает торможение гормональной секреции.

• Как SSTR2, так и SSTR5 реализуют антипролиферативные эффекты соматостатина через соответственно:
  • активацию тирозинфосфатазы,
  • угнетение фосфорилирования ERK 1/2.
• Через активацию SSTR2 и SST3 обеспечиваются эффекты апоптоза.
• В настоящее время аналоги соматостатина (SS) (препараты длительного действия, например, октреотид и ланреотид) используются в лечении объёмных образований гипофиза (в частности соматотропином и тиротропином).

Молекулярные механизмы лекарственной резистентности объёмных образований гипофиза

• Вопреки доказанному тормозящему влиянию аналогов DA и SS на клеточную пролиферацию и гормональную секрецию существует категория пациентов (10% пациентов с пролактиномой и 30 % пациентов с акромегалией):
  • устойчивых к терапии карберголином и октреоитидом, соответственно.
• Большинство пациентов с нефункциональными и АКТГ-продуцирующими объёмными образованиями гипофиза нечувствительны к действию обоих препаратов.

• Лекарственная устойчивость пролактином — это неспособность:
  • поддерживать нормальный уровень пролактина
  • добиться 50%-го уменьшения размера опухоли.

• Лекарственная устойчивость к аналогам SS у пациентов с акромегалией определяется отсутствие:
  • биохимической ремиссии ( нормальный уровень IGF1, при случайном исследовании уровень ГР < 1 мг/ л и пороговый уровень СТГ после проведения ОГТТ < 0,4 мг/ л)
  • уменьшения размера опухоли ( < 20% от изначального объёма).

• показатель смертности
• показатель летальности
• качество жизни.
• Фармакологическая резистентность аденом гипофиза может существенно влиять на:
• Устойчивость пролактином к каберголину ассоциирована с
  • инвазивностью,
  • большей агрессивностью,
  • увеличением риска развития карциномы.
• В ходе исследований последних лет были изучены различные нарушения молекулярного уровня, наличие которых может объяснить разный ответ на терапию препаратами-аналогами DA и SS.
  • К ним относятся:
    • нарушения экспрессии DRD2 и SSTRs,
    • генетические дефекты DRD2 и SSTRs,
    • нарушения в системе сигнальных путей,
    • вовлечённость белков цитоскелета.

• Многие аспекты проблемы лекарственной устойчивости нуждаются в дальнейшем комлексном рассмотрении.

Снижение экспрессии SSTRs и DRD2 клетками “устойчивых” объёмных образований

• Как правило, сниженная экспрессия рецепторов DA и SS на мембранах клеток аденомы гипофиза ассоциирована со слабым ответом на терапию.

• В частности, в отношении пролактином было доказано, что на DA-резистентных аденомах плотность рецепторов DRD2 была ниже по сравнению с DA- чувствительными объёмными образованиями.
  • Аналогично, в первом случае, отмечалась меньшая экспрессия специфических изоформ DRD2, D2S или D2L.

• В большей степени остаётся спорным вопрос о наличии корреляции между устойчивостью к SS и уменьшением экспрессии SSTRs.
  • Согласно имеющимся данным, с одной стороны, некоторые соматотропиномы устойчивы к терапии несмотря на высокий уровень экспрессии SSTR2;
  • С другой стороны, описана корреляция между подавлением секреции ГР, уменьшением опухолевой массы под действием аналогов SS, и SSTR2 мРНК и уровнем белка.

• Как бы там ни было, молекулярные механизмы, лежащие в основе снижения эксрессии DRD2 и SSTRs, остаются малопонятными.
• При изучении нарушений в генетическом аппарате и посттрансляционных механизмов учёные пришли к выводу, что ключевая роль в белок-опосредованной регуляции принадлежит цитоскелету.

Генетические дефекты SSTRs и DRD2

• В исследованиях, посвящённых изучению генетических дефектов SSTRs и DRD2, описано, что

  • мутации в экзонах и/или утрата гетерогенности в локусах, где расположены соответствующие гены, встречаются крайне редко.
• В частности, при изучении 79 пациентов с пролактиномами не было обнаружено ни 1 мутации в гене DRD2.
• В ходе секвенирования экзома у пациентов с бромокриптин-устойчивыми и бромокриптин-чувствительными пролактиномами генетических различий в экзоне, кодирующем синтез DRD2, обнаружено не было.
• При генотипировании порядка 200 пациентов с пролактиномами и контрольной группы с целью выявления обычного полиморфизма гена DRD2, было установлено, что:
  • устойчивость к DA коррелирует только с обычным полиморфизмом;
  • замещение цитозина на тимин в 957 локусе коррелирует с подверженностью мигрени и шизофрении. Это также может повлиять на фолдинг мРНК, снизив её стабильность и трансляцию.
• Так же, как и в случае с DRD2, у пациентов с лекарственной устойчивостью мутации в генах, отвечающих за синтез SSTR2 и SSTR5, обычно отсутствуют.

• Единственная мутация SSTR, описанная на сегодняшний день,- R240W, герминативная мутация в гене SSTR5, обнаруженная у пациента с акромегалией и лекарственной устойчивостью к октреотиду.

• Данная миссенс- мутация расположена в 3ей внутриклеточной петле SST5, области, критической в отношении сопряжения G-протеинов.
• В ходе исследований установлено, что взаимодействие с мутантным R240W рецептором не приводит к торможению секреции СТГ, а также клеточной пролиферации, под действием агонистов SSTR5.
• R240W рецептор сохраняет способность к снижению уровня внутриклеточного цАМФ в результате неспособности сопрягаться с GоА- белком, но не с другими G-протеинами (Gi1 , i2, i3 и GоВ), активируемыми взаимодействием с немутантными типами SSTR5.
• Считается, что полиморфные варианты гена SSTR2 не играют роли в формировании лекарственной устойчивости соматотропином к SS.
• 2 замещённых нуклеотида в промоторной последовательности гена SSTR2 в 83 и 57 позициях основного инициального сайта транскрипции не приводят к возникновению различий в клинических характеристиках, гормональном профиле или чувствительности к SS.
• В ходе изучения гена SSTR5 был обнаружен его однонуклеотидный полиморфизм.
• Т- аллель rs34037914 определяет предрасположенность к:
  • устойчивости к антипролиферативным эффектам SS
  • увеличению агрессивности новообразования
  • послеоперационным рецидивам аденом гипофиза.
• Тем не менее, утрата гетерозиготности геном SSTR5, расположенном в 16p13.3 хромосоме, — редкое явление, встречающееся при опухолях гипофиза приблизительно в 10% случаев.
• Кроме того, в сохранном аллеле отсутствовали мутации при соматотропиноме с утратой гетерозиготности в локусе SSTR5.
• Потеря гетерозиготности при это не сопровождалась формированием лекарственной устойчивости к октреотиду.
• В заключение, была обнаружена корреляция между экспрессией укороченного варианта SSTR5 (SST5TMD4), предположительно, имеющего внутриклеточную локализацию, но при этом способного к передачи сигналов и:
  • снижением способности октреоида к нормализации гормональной секреции при опухолях со слабым ответом на терапию;
  • агрессивными чертами новообразования, включая устойчивость к SS и способность к инвазии.
• Высокий уровень SST5TMD4 коррелирует со слабым ответом на терапию аналогами SS,
  • даже при условии высокой экспрессии SSTR2, обусловливающей доминантно-негативный эффект этой укороченной изоформы SSTR5 на SSTR2- ассоциированный сигнальный путь.

Пострецепторные нарушения

• Помимо нарушений на уровне рецепторов SS и DA, формирование лекарственной устойчивости аденом гипофиза может быть связано с дефектами в системе сигнальных путей.
• В пользу гипотезы «пострецепторных нарушений» как возможного механизма устойчивости к аналогам SS говорит диссоциация между:
  • антисекреторными и антипролиферативными эффектами аналогов SS в условиях организма у некоторых пациентов с акромегалией
  • результатами лабораторных экспериментов на опухолевых соматотропных клетках, в которых аналоги SS оказывают антипролиферативные эффекты без угнетения секреции ГР.
• Стимуляция SSTRs через образование связи этих рецепторов с различными представителями семейства Gi-белков приводит к угнетению гормональной секреции и клеточной пролиферации.
• Несмотря на то, что низкая экспрессия Gi1-3 — белков зафиксирована при СТГ-продуцирующих объёмных образованиях, анализ возможной корреляции с устойчивостью к аналогам SS не проводился.

• Нарушение подобной связи, или дефект нижележащего эффектора может вызвать недостаточную активацию специфического сигнального пути без затрагивания других сигнальных каскадов.
• В этой связи, установлено, что активация SSTR5 приводит к реализации соматотропными клетками антипролиферативных и антисекреторных эффектов через ассоциацию с белком-ингибитором GoA, независимо от снижения цАМФ. Таким образом, обеспечивается разобщённость между разными сигнальными путями.
• Появились данные о возможной роли дефектов G-белков в формировании лекарственной устойчивости к аналогам DA и SS.
• Снижение экспрессии Gi2-белка (не G0 и Gs) описано при каберголин-резистентных пролактиномах.
• А- субъединица G-белка-активатора заслуживает отдельного внимания. Соматические активирующие мутации в гене, кодирующем его синтез (GNAS, также известный как gsp— онкоген), обнаруживаются в 30-40% при соматотропиномах.
• Стоит заметить, что gsp— положительные новообразования характеризуются возрастающей чувствительностью к терапии аналогами SS. Это свойство, на сегодняшний день, остаётся необъяснённым, так как увеличения плотности SS рецепторов при этом не отмечается.
• Нарушения в сигнальной трансдукции SSTRs могут являться причиной классической октреотид-резистентности, которая наблюдается у пациентов с акромегалией.
• Передача сигнала может быть нарушена вследствие:
  • герминативной мутации в гене, кодирующем синтез арил-гидрокарбонового белка-рецептора (AIP);
  • низкой экспрессии AIP, даже при отсутствии мутаций.
• AIP-опухолевый супрессорный ген. Доказано, что его активация приводит к уменьшению опухолевой массы посредством ZAC1.
  • Более того, выключение AIP приводит к активации опухолевой прогрессии в гипофизе через дефектный Gi- белок.
  • Интересно заметить, что низкая экспрессия AIP не ассоциирована с резистентностью к пасиреотиду, аналогу SS, характеризующимся высоким афиннитетом к SSTR5. Это означает, что AIP не участвует в сигнальной трансдукции данного специфического подтипа SSTR.
  • Генетический анализ AIP проводился у 50 пациентов с акромегалией без семейного анамнеза этого заболевания и с лекарственной устойчивостью к аналогам SS.
  • В ходе него была установлена невысокая, но заметная распространённость герминативных мутаций супрессорного гена у этих больных.
• Таким образом, частично прояснилась роль его дефекта в резистентности к SS при спорадических соматотропиномах.
  • Fougner и соавторами была установлена корреляция между экспрессией ингибитора Raf- киназы (RKIP) и чувствительностью СТГ- продуцирующей аденомы к аналогам SS.
  • RKIP регулирует активность Raf1- киназы и, как следствие, — сигнального пути MAPK, обеспечивающего антипролиферативные эффекты SS,- а также блокирует G-белок-ассоциированный рецептор киназы2. Последний, возможно, влияет на интернализацию и деградацию SSTRs.
• Помимо активации сопряжённых G- протеинов, GPCRs воздействует непосредственно на их внутриклеточные петли через цитоплазматические и поверхностные белки, участвующие в:
  • стабилизации GPCRs
  • их десенсибилизации
  • интернализации
  • сигнальной трансдукции.
• К этим белкам относятся б-аррестины 1 и 2 (каркасные протеины), обеспечивающие десенсибилизацию и сигнальную трансдукцию нескольких GPCRs (включая SSTRs и DRD2).
• Низкая экспрессия б-аррестина 1 при соматотропиномах и пролактиномах коррелирует со снижением скорости диссоциации комплекса лиганд-SSTR2 и лучшим ответом на терапию (проявляющимся подавлением секреции СТГ) как в условиях in vitro, так и in vivo.

• О нарушении сигнальной трансдукции DRD2 как о возможном механизме лекарственной устойчивости известно значительно меньше.
• В ходе исследований установлено, что сигнальный путь TGF-b/ Smad, через который отчасти реализуются антипролиферативные эффекты DA:
• не функционирует при DA-устойчивых аденомах гипофиза;
• действует в аденогипофизе здоровых людей.
• При секвенировании экзома 6 бромокриптин-резистентных и 6 бромокриптин-чувствительных пролактином определили:
  • генетические варианты DRD2 гена
  • 10 генов, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости (например, PRB3 и PRDM2).
• Экспрессия этих генов в случае аденом, устойчивых к лечению, была ниже. Механизм, объясняющий это явление, на сегодняшний день не изучен.
• Наконец, в ходе недавних исследований установили, что специфический профиль экспрессии микроРНК ассоциирован с бромокриптин-резистентностью пролактином.
• Среди дифференциально экспрессируемых микроРНК, mir93 непосредственно снижает экспрессию p21 в MMQ клетках через воздействие на 3′-нетранслируемую область.

Принципиально новый механизм формирования лекарственной устойчивости аденом гипофиза: роль цитоскелета

• В недавнем прошлом учёные выяснили, что цитоскелет участвует в сложных механизмах формирования лекарственной устойчивости аденом гипофиза к аналогам DA и SS.

• Цитоскелет играет ключевую роль в процессах:
  • поддержания формы клетки
  • миграции клеток и их адгезии
  • клеточном делении
  • стабилизации положения цитоплазматических органелл
  • движении;
  •  внеклеточной сигнальной трансдукции
  • регуляции активности нескольких рецепторов.

• К основным структурным компонентам цитоскелета относятся:
  • микротрубочки
  • промежуточные филаменты
  • микрофиламенты, возникающие в результате полимеризации различных мономеров.
• Такие полимеры:
  • характеризуются структурными и функциональными различиями
  • подвергаются непрерывному обновлению и перестройке
  • способны особым образом связываться с различными семействами белков- партнёров.

• Микрофиламенты:
  • наиболее тонкие среди филаментов
  • участвуют в поддержании формы клетки и её подвижности
  • состоят из актиновых нитей (F- актин), возникающих в результате полимеризации мономерного глобулярного актина (G- актина).
• Многие семейства актин-связывающих белков, участвующие в формировании актин-связывающего домена, регулируют процессы полимеризации/ деполимеризации, а также объединяют F- актин в пучки и сети.
• Среди них, филамины (FLN) являются актин-стабилизирующими белками. Они способны к формированию сетей из взаимно перпендикулярных актиновых филаментов, а также, будучи каркасными протеинами, — к связыванию различных белков-партнёров.

Филамин А: структура и функции

• Семейство филаминов состоит из 3 гомологичных белков с высокой молекулярной массой:
  • филамина А (FLNA)
  • филамина В (FLNB)
  • филамина С (FLNC).
• Синтез этих белков кодируется различными генами, расположенными в хромосомах Х, 3 и 7, соответственно.
• 3 вышеперечисленные изоформы филамина у млекопитающих характеризуются высокой степенью гомологичности кодирующих последовательностей и высокой стабильностью геномной организации.

• Человеческий FLNA , кодируемый Xq28:
  • первый актин-стабилизирующий белок, обнаруженный не в клетках мышечной ткани;
  • наиболее распространённая изоформа филамина среди взрослой популяции.
• FLNA и FLNB экспрессируются повсеместно, в то время как FLNC — только в скелетных и сердечной мышцах.
  • В ходе нескольких исследований было доказано, что филамины необходимы для нормального развития человеческого организма
  • Более того, мутации в соответствующих генах приводят к формированию пороков развития мозга, костей и сердца с возможными летальными последствиями.

• FLNA способен связывать множество других белков- партёров, включая:
  • некоторые GPCRs
  • интегрины
  • ионные каналы, обеспечивая их фиксацию к актину цитоскелета;
  • внутриклеточные сигнальные молекулы
  • киназы
  • факторы транскрипции ( все вышеперечисленные молекулы участвуют в сигнальной трансдукции).
  • трансмембранные:
• Основная функция FLNA — стабилизация структуры трёхмерной F-актиновой сети (однако, функции FLNA не исчерпываются структурной).
• В частности, в результате мутации в гене, кодирующем FLNA, развиваются:
  • перивентрикулярная (узелковая) гетеротопия
  • пороки развития головного мозга вследствие аномальной миграции нейронов (при которой группа нейронов теряет способность перемещаться в развивающуюся кору головного мозга)
  •  широкий спектр врождённых пороков (ухо-нёбно-пальцевой синдром, фронтометафизиарная дисплазия, остеодисплазия Мелника- Нидлса).
• Все эти взаимодействия регулируются путём:
  • фосфорилировния FLNA
  • протеолиза
  • механических усилий
  • конкуренции
  • мультимеризации белков- партнёров.
• Множество функций FLNA возможны благодаря уникальной структуре молекулы.
  • Каждый мономер имеет актин-связывающий домен (ABD) на N- конце, состоящий, в свою очередь, из 2 кальпонин-гомологичных доменов, за которыми следуют 24 иммуноглобулин-подобных повтора ( состоящих приблизительно из 96 аминокислотных остатков).
    • 2 кальпаин- чувствительные шарнирные области (H1 и H2) разделяют 24 повтора в rod-1 домене (повторы 1-15), rod- 2 домене (16-23) и 24 повтор.
  • Второй ABD с более низким аффинитетом расположен в rod-1, в то время как rod-2 вовлечён во взаимодействие с белками-партнёрами.
    • 24 повтор — самоассоцированный домен, который обеспечивает гомодимеризацию FLNA. При этом образуются V-образные гибкие структуры, что приводит к перпендикулярной сшивке актиновых филаментов.
  • Многообразие внутри семейства филаминов обеспечивается засчёт альтернативного сплайсинга их мРНК.
  • Используются альтернативные поли- (А)сигналы. В некоторых случаях происходят делеции в отдельных доменах.
  • В частности, в ходе предшествующих исследований была выявлена последовательность из 8 аминокислот в 15 повторе FLNA, а также внутренняя делеция 41 аминокислоты между 19 и 20 повторами (остатки 2127 — 2167), что соответствует варианту-1 FLNA, который широко экспрессируется на низком уровне.
  • FLNA состоит из 2 субъединиц, каждая массой 280 килодальтон.

Вклад FLNA в формирование устойчивости пролактином к агонистам DRD2

• Впервые взаимодействие FLNA с DRD2 было продемонстрировано Lee и соавторами при проведении дрожжевого двугибридного скрининга и анализе белок-белкового взаимодействия.
  • Примечательно, что связывание с FLNA увеличивало эффективность сопряжения DRD2 с аденилатциклазой, а также играло роль в организации поверхностных рецепторов клетки.
• Почти одновременно, в ходе другого исследования (в котором 3 внутриклеточная петля DRD2 использовалась в качестве затравки при проведении двугибридного анализа с целью скрининга библиотеки кДНК головного мозга) подтвердилась специфическая DRD2/FLNAассоциация.
• Таким образом, функции специфических участков FLNA (повтор 19) и DRD2 (аминокислоты 211- 241 на N- конце 3 интрацеллюлярной петли) были изучены более пристально.
  • FLNA и DRD2 совместно располагались в клетках полосатого тела крыс.
  • Авторы установили, что DRD2 локализуется преимущественно внутриклеточно в М2, клеточной линии меланомы человека, не экспрессирующей FLNA.
  • Тогда как FLNA располагается на плазматической мембане A7 клеток, той же линии, прочно трансфицированной с FLNA.
  • Отсюда можно заключить, что FLNA нуждается в поверхностном расположении DRD2 что показано на примере использования доминантно-негативной укороченной формы FLNA (повторы 18-19, содержащие в себе DRD2, но не актин-связывающий домен).
• Схожие эффекты FLNA в регуляции DRD2 обнаружены при пролактиномах.
  • Сначала было установлено снижение DRD2 при DA-резистентных аденомах (что прежде связывали с лекарственной устойчивостью), сопровождается низкой экспрессией FLNA.
  • В ходе лабораторных исследований, начавшихся с этого экспериментального наблюдения, доказали, что нарушение на уровне FLNA в виде выключения генов или сверхэкспрессии в первичной культуре клеток пролактиномы приводит к соответствующим изменениям DRD2.
  • Кроме того, снижение выделения пролактина и фосфорилирование ERK 1/ 2, ассоциированные с применением DRD2 агонистов, нарушаются после выключения гена FLNA.
  • В то же время, DA- резистентные пролактиномы, экспресссия FLNA при которых недостаточна, восстанавливают чувствительность к терапии после трансфекции с FLNA.
• Опыты, проведённые на MMQ клетках крыс, клеточной модели пролактиномы, участвующей в эндогенной экспрессии функциональных DRD2 и FLNA, показали, что FLNA:
  • необходим для взаимодействия с DRD2 клеточной мембраны
  • препятствует лизосомальной деградации DRD2.
  • регулирует жизненный цикл DRD2, вызывая либо его перестройку, либо лизосомальную деградацию.
• FLNA непосредственно взаимодействует с б-аррестинами, участвующими в перемещении DRD2,- из чего можно заключить, что стабильность DRD2 регулируется комплексом рецептор-FLNA-аррестин.
• Приведённые выше данные говорят в пользу наличия у FLNA протективной функции в отношении стабильности рецепторов.
• Помимо DRD2 речь также идёт о:
  • кальций-чувствительном рецепторе
  • кальцитониновом рецепторе
  • муковисцидозном трансмембранном регуляторе проводимости
  • высокоафинном рецепторе IgG Fc-гамма-RI.

• Кроме структурной функции, заключающейся в фиксации DRD2 к актину цитоскелета и регулировании положения рецептора и его стабильности, FLNA также принимает участие в передаче сигнала по сигнальному пути.
• В гипофизе предусмотрен значительный резерв DRD2 для угнетения секреции пролактина: плато достигается при загруженности рецепторов на 40% (в гипофизарных клетках крысы).
• 60% уменьшение количества DRD2, измеренное в пролактиномах и MMQ -клетках после снижения FLNA, может являться не единственной причиной утраты влияния DRD2 на секрецию пролактина, а также на клеточную пролиферацию.

• FLNA играет ключевую роль как в выраженности экспрессии DRD2, так и в функционировании сигнальных каскадов в лактотрофных клетках. В связи с этим, дефицит FLNA может расцениваться как один из механизмов формирования резистентности к DA, ранее отмечавшейся при пролактиномах.

• Для прояснения молекулярных механизмов формирования резистентности аденом гипофиза, связанной со снижением экспрессии FLNA , потребуется проведение новых исследований.
• На сегодняшний день в CpG-островке гена FLNA, области, которая с высокой долей вероятности регулирует функции молекулы, не обнаружено мутаций за исключением эпигенетического сайлесинга.

Роль FLNA в регуляции экспрессии SSTR2 и передаче сигналов по сигнальному пути при СТГ-продуцирующих аденомах

• Считается, что помимо DRD2, FLNA также играет ключевую роль в регуляции экспрессии SSTR2 и, таким образом, оказывает существенное влияние на чувствительность к терапии SS у пациентов с акромегалией.

• Прямое взаимодействие FLNA с SSTR2 впервые было продемонстрировано при помощи поверхностного плазмонного резонанса.
• Контакт возникает между первой внтуриклеточной петлёй SSTR2 и повторами 19-20 FLNA. Благодаря этому взаимодействию положение SSTR2 в клеточной мембране стабильно.
• Против того, что было замечено в отношении DRD2, SSTR2, в свою очередь, правильно ориентирован в плазматической мембране M2-клеток, не экспрессирующих FLNA. Однако, после стимуляции агонистом SSTR2 скорость интернализации в М2 клетках возрастает по отношению к A7.
• Авторы исследования также установили, что при помощи FLNA реализуется программа апоптоза. Молекулярный механизм заключается в конкурентном взаимодействии между FLNA и p85, регуляторной субъединицей PI3K (фосфоинозитид-3-киназы), в результате которого происходит прямое связывание с SSTR2.
• Связывание FLNA с соответствующим лигандом приводит к разрушению комплекса SSTR2-p85 и последующему угнетению PI3K.
• В ходе недавних исследований изучалось регулирующее влияние FLNA на SSTR2 у пациентов с соматотропиномами.
• В отличие от экспрессии DRD2 при пролактиномах, экспрессия FLNA при СТГ-продуцирующих объёмных образованиях гипофиза не коррелирует с плотностью SSTR2, а выключение гена FLNA в человеческих опухолевых клетках не влияет на экспрессию SSTR2 и их стабильность относительно мембраны.
• Между тем, через использование различных доминантно-негативных мутантных вариантов FLNA, у которых избирательно была угнетена способность к взаимодействию с SST2 (FLNA повторы 19-20) или функция «каркаса» для белков- партнёров (FLNA 21-24), было доказано, что роль FLNA складывается из 2 компонентов:
  • структурного (стабилизация экспрессии SST2 вследствие пролонгированной стимуляции специфическим агонистом)
  • функционального ( участвует в реализации сигнального пути).

• Используя в качестве модели GH3-клетки крысы, продуцирующие СТГ, авторы исследования продемонстрировали, что стабильность комплекса FLNA/SSTR2 после пролонгированной стимуляции агонистами нарушается.
• Возможно, это объясняется влиянием FLNA на лизосомальную деградацию SSTR2, так как даун-регуляция, вызванная связыванием SSTR2 с лигандом устраняется в случае её [лизосомальной деградации] предотвращения.
• Также в рамках исследования оценивалось влияние FLNA на процесс интернализации SSTR2.

• В ходе лабораторных экспериментов на соматотрофах получены данные о том, что FLNA необходим для SSTR2-опосредованного снижения активации циклина D1 и каспазы 3/7. Таким образом, FLNA играет ключевую роль в обеспечении антипролиферативного и проапоптозного эффектов SSTR2.
• Было сделано наблюдение, что повторы FLNA 21-24, не препятствующие взаимодействию SSTR2 с эндогенным FLNA, могут помешать реализации программы апоптоза SST2. Также, зная об SSTR2-индуцированном торможении ERK1/ 2, можно утверждать, что карскасные свойства FLNA необходимы для сборки сигнальных комплексов.
• Полученная в данном исследовании информация проясняет роль FLNA в формировании реакции на терапию аналогами SS при соматотропиномах.
• Низкая экспрессия FLNA, приводящая к потере сообщения SSTR2 с нижележащими молекулами сигнального пути, может объяснить лекарственную резистентность соматотропином к аналогам SS, даже при условии достаточной экспрессии SSTR2.
• Интересно, что в сплайс-варианте-1 FLNA, экспрессия которого на низком уровне обнаруживается повсеместно, не достаёт 41 аминокислоты между 19 и 20 повторами — области, которая отвечает за связывание и с DRD2, и с SST2.
• По результатам проведения ЯМР- спектроскопии установлено, что в сплайс-варианте 19 повтор развёртывается в соответствии со своей природой, реализуя биологический эффект.
• Сплайс-вариант FLNA в большей степени способен к связыванию с интегринами по сравнению с диким типом белка. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что альтернативный сплайсинг может выступать в качестве регуляторного механизма связывания FLNA с белками-партнёрами, а также влиять на чувствительность аденом гипофиза к терапии аналогами SS/ DA.

Возможное влияние FLNA на агрессивность и инвазивные свойства аденом гипофиза

• Помимо регуляции GPCR, FLNA участвует в обеспечении подвижности клетки. FLNA вызывает ограниченное выбухание мембраны мигрирующих клеток, играя роль каркаса для белков, обеспечивающих перемещение и адгезию клеток.

• Наблюдение, что при перевентрикулярной гетеротопии полное выключение гена FLNA вызывает нарушение миграции нейронов в кору больших полушарий , в купе с эспериментальными данными, полученными при исследовании FLNA-недостаточных M2 клеток, не способных к передвижению, означают, что FLNA принадежит ключевая роль в миграции клеток.
• В противовес этому, было доказано, что гиперэкспрессия FLNA угнетает клеточную подвижность. В этом случае FLNA препятствует перемещению клеток, их инвазии и метастазированию.
• Таким образом, можно заключить, что положительное или отрицательное влияние FLNA на подвижность клеток определяется их типом и уровнем экспрессии данного белка.

• Большая часть объёмных образований гипофиза- доброкачественные опухоли, однако часто имеется локальная инвазия, которая в значительной степени ухудшает прогноз нейрохирургического лечения.
• В связи с тем, что DA-резистентность пролактином ассоциирована с увеличением агрессивности этих опухолей и их способностью к инвазии, а снижение уровня FLNA коррелирует с устойчивостью к дофаминэргическим препаратам, можно предположить, что низкая экспрессия FLNA может быть причиной инвазивного роста опухоли.

• До сих пор в литературе отсутствуют данные о влиянии экспрессии FLNA на клеточные миграцию и инвазию.
• Потребуется проведение дальнейших исследований для того, чтобы оценить вклад нарушений уровня FLNA в клеточные инвазию и агрессивность, а также рецидивы опухолей гипофиза.

Заключение

• Молекулярные механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости объёмных образований гипофиза к аналогам DA и SS, могут действовать на разных уровнях, начиная с активации рецептора агонистом до уровня реализации конечного биологического ответа в виде подавления гормональной секреции и уменьшения размера опухоли.
• В отсутствии дефекта SSTR2, SSTR5 и DRD2 генов были обнаружены нарушения в молекулах, задействованных в передаче сигналов по пути, специфичному для этого рецептора, а также участвующих в регуляции экспрессии белков-рецепторов.
• Появляется всё больше данных в пользу того, что экспрессия DRD2, SSTR2, локализация и реализация сигнальной трансдукции регулируются взаимодействием со структурным белком цитоскелета FLNA. Это в очередной раз подчёркивает множественность функций цитоскелета в физиологии клетки.
• Будущие исследования будут направлены на изучение генетических и посттрансляционных модификаций, влияющих на экспрессию и функции FLNA. Это поможет прояснить сложные механизмы формирования лекарственной устойчивости при аденомах гипофиза.

Источник:

1. Peverelli E, Treppiedi D, Giardino E, Vitali E, Lania AG, Mantovani G. Dopamine and Somatostatin Analogues Resistance of Pituitary Tumors: Focus on Cytoskeleton Involvement. Front Endocrinol (Lausanne). 2015;6:187.doi:10.3389/frendo.2015.00187.