Холинергическая стимуляция и аутоиммунный сахарный диабет

• Сахарный диабет 1 типа (СД1) — результат опосредованного Т-клетками повреждения β-клеток поджелудочной железы и снижения синтеза инсулина.
  • Холинергический противовоспалительный путь представляет собой физиологическую связь между центральной нервной и иммунной системой, осуществляемую через блуждающий нерв. Его значение состоит в контроле высвобождения провоспалительных цитокинов.
• Используя стрептозотоцин (MLD-STZ) для индуцирования экспериментального аутоиммунного диабета, исследовался потенциал регуляции развития гипергликемии путем введения параоксона, высокоспецифического ингибитора ацетилхолинэстеразы (АХЭ).
• Было выявлено, что предварительное применение параоксона предотвращало гипергликемию у мышей, принимавших STZ C57BL / 6.
  • Это коррелировало с уменьшением инфильтрации Т-клетами  островков поджелудочной железы и сохранением структуры и функции β-клеток.
• Анализ экспрессии генов ткани поджелудочной железы показал, что повышенная периферическая холинергическая активность предотвращает STZ-опосредованное снижение продукции инсулина, что связано с уменьшением провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6 и IL-17.
• Анализ внутриклеточных цитокинов  Т-клеток селезенки показал, что ингибирование АХЭ привело к сдвигу индуцированного STZ иммунного ответа от экспрессии преимущественно ИЛ-17 к экспрессии ИФНγ Th1-клеткам.
• В соответствии с этим, ингибирование AХЭ не позволило предотвратить гипергликемию, индуцированную STZ, у мышей с дефицитом IFNγ.
• Результаты исследования доказывают, что СД1 у мышей может быть предотвращен путем ингибирования АХЭ и позволяют разработать стратегию для модулирования тяжести заболевания.

ВВЕДЕНИЕ

• Сахарный диабет 1 типа (СД1) — опосредуемое Т-клетками аутоиммунное заболевание, при котором избирательно разрушаются инсулин-продуцирующие β-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы.
• Гипергликемия предшествует доклинической фазе инсулита, характеризующегося инфильтрацией островков поджелудочной железы Т-лимфоцитами, миелоидными клетками и NK-клетками.
• Доказано, что на развитие болезни влияют генетические и экологические факторы, включая вирусные инфекции, пищевые антигены, токсины и стресс.
• Аутоиммунный ответ возникает у генетически предрасположенных лиц, когда физиологическое ремоделирование островков, вирусные инфекции или воспалительные цитокины индуцируют гибель β-клеток.
• Выделение специфических для β-клеток антигенов вызывает активацию воспалительных Т-клеток, что приводит к инсулиту и, в конечном счете, к разрушению β-клеток.
• Было разработано несколько экспериментальных моделей для изучения СД1, в том числе:
  • Спонтанно развивающийся СД1 (исследовались крысы для биообработки (BB); не страдающие ожирением мыши с диабетом (NOD)).
  • Химически индуцированный СД1 (при множественном применении стрептозотоцина в низких дозах (MLD-STZ); аллоксан).
• В модели «мыши MLD-STZ» исследования показали, что разрушение β-клеток и развитие гипергликемии напоминают развитие у людей СД1, опосредованного воспалительными Т-клетками (как CD4, так и CD8), и регулируются воспалительными цитокинами.
  • Эта модель имеет преимущество перед моделью NOD в том, что она индуцирует только аутоиммунный диабет, а не любое другое системное аутоиммунное заболевание.
• Нервная система играет определенную роль в регуляции иммунных реакций и наоборот.
  • Достаточно изучена способность холинергической системы модулировать иммунные реакции.
  • Основной парасимпатический нерв с холинергическим механизмом иннервации — блуждающий нерв — иннервирует многие органы, включая желудочно-кишечный тракт, поджелудочную железу и лимфоидные ткани, где нервные окончания образуют синаптические контакты с лимфоидными клетками.
  • Мускариновые и никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Ах-Р) экспрессируются во многих типах клеток иммунной системы, включая лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки
  • Это позволяет предположить, что ацетилхолин (АХ) может действовать как нейроиммуномодулятор при взаимодействии между нервной и иммунной системами.
• Т-лимфоциты экспрессируют мускариновые (мАх-Р) и никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАх-Р) и синтезируют АХ и ацетилхолинэстеразу (АХЭ).
  • АХ-стимуляция Т-клеток через субъединицу α7 нАх-Р снижает индуцированную митогеном пролиферацию и секрецию провоспалительных цитокинов.
  • Аналогично, активация α7 нАх-Р на макрофагах ингибирует секрецию ФНО-α.
  • Напротив, стимуляция через мАх-Р индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов.
• Эти данные легли в основу концепции холинергического противовоспалительного пути или воспалительного рефлекса, который, как хорошо известно, противодействует воспалению, вызванному эндотоксемией.
  • В этом рефлекторном пути наличие воспалительных молекул на периферии стимулирует афферентный блуждающий нерв, который передает сигнал в мозг, который регулирует через эфферентный блуждающий нерв продуцирование провоспалительных цитокинов.
  • Ингибирование АХЭ способствует выживанию мышей после смертельной инфекции сальмонеллеза, передающейся фекально-оральным путем, подчеркивая физиологическое значение этого пути для формирования иммунитета слизистых оболочек.
• Холинергическая стимуляция снижает тяжесть воспаления при таких состояниях как экспериментальный аутоиммунный энцефалит (ЭАЭ), экспериментальная аутоиммунная миастения и болезнь Альцгеймера.

Несколько исследований человека, а также моделей спонтанного (мышей NOD) и химически индуцированного (MLD-STZ) СД1 у животных указывают на решающую роль, которую играют клетки Th17 в патогенезе аутоиммунного диабета.

• В дополнение к ИЛ-17A, ключевому цитокину, продуцируемому подмножеством Th17-лимфоцитов, эти клетки также секретируют множество других медиаторов воспаления, включая ИЛ-17F, ИЛ-21, ИЛ-22, ФНОα, GM-CSF и ИЛ-6, которые совместно управляют соответствующей иммунопатологией.
  • Напротив, индукция ИФγ у мышей NOD защищает от развития диабета путем подавления активности Th17 и ингибирования продукции ИЛ-17. Поэтому ИЛ-17 и ИФγ, по-видимому, играют разнообразные и часто кросс-регулирующие функции во время развития СД1.
• Учитывая центральную роль Т-клеток и макрофагов в развитии СД1 и существование холинергической иннервации в поджелудочной железе, исследовался потенциальный иммуномодулирующий эффект ингибирования АХЭ на развитие диабета с использованием мышиной модели MLD-STZ.
  • При использовании параоксона, как системного ингибитора АХЭ, было выяснено, что холинергическая активация предотвращает развитие гипергликемии путем ингибирования воспаления в островках поджелудочной железы и уменьшения гибели β-клеток.
  • Ингибирование АХЭ препятствует дифференцировке CD4 + T-клеток в клетки Th17, продуцирующие ИЛ-17, и вместо этого способствует их дифференцировке в клетки Th1, экспрессирующие ИФγ.
  • Ингибирование АХЭ не позволяет модулировать гипергликемию от стрептозотозина (STZ) у мышей с IFNγ-дефицитом (IFNγ — / -), что доказывает решающую роль ИФγ в АХ-опосредованном ингибировании аутоиммунной реакции против островковых β-клеток.
• Эти результаты позволяют разработать стратегию развития противодиабетической терапии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

• Мыши C57BL / 6 были приобретены у Harlan Olac (Bicester, United Kingdom) и разведены на животноводческом объекте Колледжа медицины и здравоохранения, Университета ОАЭ.
• Мыши IFNγ — / — были приобретены в лабораториях Джексона (США) и предоставлены д-ром Мариам Аль-Шамси нашему учреждению.
• Для экспериментов использовали мышей в возрасте 8-10 недель (диапазон массы 20-22 г).
• Все исследования с участием животных проводились после одобрения комитета по этическим исследованиям на животных Колледжа медицины и здравоохранения, Университета ОАЭ.

ПРЕПАРАТЫ

• Параоксон — фосфорорганическое соединение, является высокоспецифичным, необратимым, ингибитором АХЭ.
  • Раствор (10 ммоль / л) был приготовлен в ацетоне.
  • Рабочий раствор для внутрибрюшинной (вб) инъекции готовили ex tempore в пирогенном солевом растворе до концентрации 80 нмоль / мл.
  • Конечная концентрация ацетона в растворе параксона, используемом для вб инъекции составила ~ 108 мкМ.
• Каждая мышь получала 40 нмоль / день параоксона или физиологического раствора в объеме 0,5 мл.
• STZ (Sigma) получали ex tempore в цитратном буфере (pH 4,5) и использовали вб в дозе 60 мг / кг / день на мышь, если не было указано иных данных.

ИНДУЦИРОВАНИЕ ДИАБЕТА

• Для индукции аутоиммунного диабета использовалась модель MLD-STZ.
• Мышам C57BL / 6 и IFNγ — / — вводили пять последовательных суточных доз STZ; контрольные мыши получали цитратный буфер.
• В разное время после введения STZ была взята кровь из хвостовой вены, чтобы определить уровень глюкозы с использованием One-Touch-ultrastrip.
• Гипергликемия определялась как уровень глюкозы в крови натощак > 200 мг / дл.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ

• 20 мышей случайным образом распределили на две группы (по 10 животных на группу).
  • Группа I была контрольной, мышам этой группы ежедневно вводились интраперитонеальные инъекции стерильного физиологического раствора в течение 3 недель.
  • Мышам II группы ежедневно вводили параоксон в течение 3 недель.
• Мышей взвешивали еженедельно, одновременно с этим бралась кровь на определение активности АХЭ.
• В конце лечения каждая группа была случайным образом разделена на две подгруппы: A и B.
  • Группы IA (Салин) и IIA (параоксон) ежедневно получали инъекции цитратного буфера, тогда как группы IB (Салин / STZ) и IIB (параоксон / STZ) ежедневно получали инъекцию STZ в течение пяти последовательных дней.
• От мышей, умерших ( после воздействия эфира) на 10 и 18 дни  после введения STZ, брали поджелудочную железу, селезенку и сыворотку крови.
• В некоторых экспериментах следили за выживанием мышей до 60 дней.

АКТИВНОСТЬ АХЭ В ЭРИТРОЦИТАХ

• Свежеприготовленные, разведенные, образцы венозной крови инкубировали с ДТНБ (Дитионитробензойная кислота) (10 мМ) и этопропазином (6 мМ) в течение 20 мин при 37 ° С перед добавлением ацетилтиохолина.
• Изменение оптической плотности ДТНБ измеряли при 436 нм.
• Активность АХЭ рассчитывали с использованием коэффициента поглощения TNB- при 436 нм (ε = 10,6 мМ-1 см-1).
• Значения были нормированы на содержание гемоглобина (Hb) (определяемого как цианметгемоглобин) и выражались в  mU / мкМ / Hb.
• Все активности ферментов выражали в процентах от базовой активности (100%).

ГИСТОЛОГИЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЯ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

• Иссеченная поджелудочная железа была обработана для гистологического анализа в соответствии с установленным протоколом.
• Частички ткани окрашивали гематоксилином и эозином (H & E), а изображения фиксировались с помощью микроскопа Olympus BX53, оснащенного цифровой камерой DP26.
• Косвенное иммуноокрашивание для инсулина проводили с использованием поликлонального антитела морской свинки, а затем FITC-конъюгированного ослиного IgG против гвинейской свиньи.
• Для обнаружения инфильтрирующих Т-клеток и макрофагов использовался трехшаговый протокол окрашивания.
  • Для Т-лимфоцитов использовали CD3-специфические кроличьи поликлональные АТ (Dako) с последующим биотинилированным овечьим Ig против кролика (AbD Serotec, Hercules, CA, США) и, наконец, streptavidinFITC.
  • Для макрофагов использовались mAb крыс F4 / 80, а затем стрептавидин-HRP и DAB.
  • Препараты с флуоресценцией контрастировали с иодидом пропидия (BD Biosciences, США), а затем исследовали и фотографировали под конфокальным микроскопом Nikon C1 с лазерным сканированием.
  • Препараты, окрашенные DAB, контрастировали с гематоксилином, рассматривали и фотографировали с помощью Olympus BX53.
• Гистологическое количественное определение клеток CD3 + и F4 / 80 + проводили на двух-четырех последовательных участках на одном животном и использовали от четырех до пяти мышей на экспериментальную группу.
• Все островки Лангерганса, найденные в каждом участке, были включены в количественную оценку, которая была проведена вслепую.

АНТИТЕЛА И ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ

• Исследование клеток селезенки проводили с использованием многоцветного анализа FACS стандартным способом.
• Клетки окрашивали комбинацией непосредственно конъюгированных mАТ, промывали и анализировали с использованием FACSCanto II.
• Использовали антитела CD3-FITC, CD4-APC и CD8-APC-Cy7, CD19-PE-Cy7 и CD11c-PE и CD11b-PE-Cy7.
• Нежизнеспособные клетки, окрашивающиеся положительно с помощью 7AAD красителя, были исключены из анализа.
• Данные, полученные при исследовании 50 000 клеток, анализировали с использованием программного обеспечения FACSDiva.

АНАЛИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ

• Готовились суспензии из одиночных клеток селезенки, 2 × 106 клеток / мл высевали в 24-луночные планшеты и стимулировали PMA (100 нг / мл) / иономцина (1 мкг / мл) в течение 4 ч при 37 ° С в присутствии брефелдина А.
• После стимуляции клетки сначала окрашивали антителами CD4-APC и CD8-APC-Cy7, ресуспендировали в растворе фиксации / пермеабилизации и, наконец, окрашивали антителами против IL-17A-PE и антителами против IFNγ-PE-Cy7, затем использовали FACSCanto II.
• Данные, полученные при исследовании  50 000 клеток, анализировали с использованием программного обеспечения FACSDiva.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ RT-ПЦР

• qRT-ПЦР проводили, как описано выше, на РНК, экстрагированной из селезенки и поджелудочной железы у каждого животного.
• После экстракции и очистки РНК кДНК синтезировали с использованием реагентов обратной транскрипции Taqman по протоколу производителя.
• Праймеры и зонды TaqMan использовались для изучения экспрессии воспалительных маркеров IL-1β, IL-6, IL-12p40, IL-17A, IFNγ и инсулина и IL-23 и TNFα.
• Уровни транскрипции генов-мишеней были нормализованы в соответствии с методом dCq до соответствующих уровней мРНК конститутивного гена HPRT.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА И ЦИТОКИНОВ

• Анализировался уровень инсулина в образцах сыворотки крови с помощью сэндвич метода ИФА, анализ был выполнен в соответствии с инструкциями производителя.
• Чувствительность анализа составляла 188 пг / мл.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

• Статистическую значимость между контрольными и обработанными группами анализировали с использованием непарного двухстороннего t-теста с использованием статистической программы программного обеспечения GraphPad Prism версии 6.
• Для множественных сравнений использовалась однонаправленная ANOVA с тестом Tukey.
• Для анализа данных повторных измерений использовалась двухсторонняя ANOVA с пост-тестом Bonferroni.
• Анализ выживаемости проводили по кривым выживаемости Каплана-Мейера и логарифмическому рангу, используя ту же программу GraphPad Prism.
• Различия между экспериментальными группами считались значимыми, когда значения р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГИПЕРГЛИКЕМИЯ, ИНДУЦИРОВАННАЯ MLD-STZ

• Сначала проводились исследования для оптимизации дозы STZ, необходимой для индукции гипергликемии (уровень глюкозы в крови> 200 мг / дл) у мышей C57BL / 6.
• Животных разделили на три группы, каждая из которых получала 40, 50,  60 мг / кг дозы STZ соответственно, в течение пяти дней подряд.
• Процент мышей, у которых развилась гипергликемия, составлял 0, 50 и 100% в 21 день после введения STZ при 40, 50 или 60 мг / кг соответственно.
• Для всех последующих исследований использовалась доза 60 мг / кг STZ.

ИНГИБИРОВАНИЕ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПРЕДОТВРАЩАЕТ ГИПЕРГЛИКЕМИЮ И СОХРАНЯЕТ ПРОДУКЦИЮ ИНСУЛИНА

• Чтобы исследовать потенциальный эффект ингибирования АХЭ на развитие экспериментального диабета, мышей C57BL / 6 ежедневно обрабатывали параоксоном или физиологическим раствором в течение 3 недель, а затем вводили MLD-STZ (или физиологический раствор) и следили за развитием гипергликемии.
• У контрольных мышей никаких изменений в уровнях глюкозы не наблюдалось (гипергликемия развивалась только в экспериментальных группах солевого раствора или параоксона).
• У обработанных солевым раствором мышей, получивших STZ, развивалась прогрессирующая гипергликемия, впервые проявившаюся через 7 дней после введения STZ и продолжавшаяся до 51 дня.
  • У всех животных в этой группе развивался сахарный диабет к 18-ому дню после введения STZ.
  • Напротив, несмотря на начальное умеренное повышение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое на 7-й день, мыши, предварительно обработанные параоксоном до STZ, были устойчивы к развитию гипергликемии.
  • Это оставалось очевидным до 51 дня после введения STZ, максимального периода наблюдения.
• Уровни инсулина в сыворотке определяли на 10-й и 18 дни после инъекции STZ.
• У мышей, обработанных физиологическим раствором и параоксоном, в оба момента времени наблюдались одинаковые уровни сывороточного инсулина.
  • Для обработанных STZ мышей, несмотря на то, что сывороточный инсулин был на нормальном уровне на 10-й день после введения, его уровень значительно снизился к 18-му до 64% контроля.
  • Напротив, никакого снижения уровня инсулина в сыворотке не наблюдалось у мышей, предварительно обработанных параоксоном, за которым следует введение STZ.
  • Уровни сывороточного инсулина у мышей, обработанных параоксоном / STZ, как правило, были выше, чем обработанных солевым раствором, на 10-й и 18-й день после инъекции STZ (в 2,6 раза и 1,6 раза соответственно), причем разница была статистически значимой на последней дате.
  • Различия в уровнях инсулина в сыворотке крови между группами – солевой раствор / STZ и параоксон / STZ на 18-й день были очень значительными и обратно коррелировали с уровнями глюкозы в сыворотке.
• Экспрессия мРНК инсулина также анализировалась в ткани поджелудочной железы на 18-й день после лечения STZ.
  • Резкое увеличение экспрессии инсулина в 10,6 раз наблюдалось у мышей, обработанных параоксоном, по сравнению с контрольной группой солевого раствора.
  • Обработка STZ (солевой / STZ-группа) приводила к 12-кратному снижению уровня мРНК инсулина по сравнению с контрольной группой солевого раствора.
  • У мышей, предварительно обработанных параоксоном до STZ (параоксон / STZ-группа), уровни мРНК инсулина были в основном аналогичны уровням, наблюдаемым в контрольной группе солевого раствора.
• Иммуногистохимический анализ продуцирующих инсулин β-клеток в ткани поджелудочной железы выявил постепенную потерю этих клеток у обработанных STZ мышей (солевой / STZ-группы), что было очевидно, начиная с 10-го дня после введения STZ и продолжалось до 60-го дня.
  • Напротив, у мышей, предварительно обработанных параоксоном (параоксон / группа STZ), наблюдались сохранение островков и защита от STZ-индуцированной потери β-клеток, хотя и не полная, до 60 дня.
• Эти результаты показывают, что ингибирование АХЭ увеличивает экспрессию мРНК инсулина в клетках поджелудочной железы и предотвращает гипергликемию, индуцированную STZ.

ИНГИБИРОВАНИЕ АХЭ ПРЕДОТВРАЩАЕТ ИНСУЛИТ И РАЗРУШЕНИЕ ОСТРОВКОВ, ИНДУЦИРОВАННОЕ MLD-STZ

• При окрашивание ткани поджелудочной железы гематоксилином и эозином наблюдалось сильное окрашивание островков в группе солевого раствора / STZ на 10 и 18 день после введения STZ.
• Предварительная обработка параоксоном приводила к инфильтрации островковых клеток на 10-й день (параоксон / группа STZ), а к 18 дню островки поджелудочной железы оказались совершенно здоровыми без признаков инсулита.
• В островках солевых или параоксоновых контрольных групп не было обнаружено никаких инфильтрирующих клеток.
• Иммуногистологический анализ островков на 10 и 18 день показал присутствие CD3 + Т-клеток и F4 / 80 + миелоидных клеток у обработанных STZ мышей.
  • Степень инфильтрации Т-клетками значительно снижалась у мышей, предварительно обработанных параоксоном.
• На 10-й день Т-клетки распределялись равномерно по островкам как солевого раствора / STZ, так и параоксонных / STZ-групп.
• На 18-й день у мышей группы параоксон / STZ наблюдалось лишь несколько Т-клеток, расположенных главным образом на периферии островков, тогда как в группе солевой раствор / STZ эти клетки были равномерно распределены внутри островков.
• Введение STZ также приводило к значительному увеличению внутриклеточного количества макрофагов, независимо от полученной предварительной обработки.
  • Никаких существенных различий не наблюдалось между контрольной группой солевого раствора и параоксоновой контрольной группой.

Затем исследовалась экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов в ткани поджелудочной железы на 18-й день после обработки STZ.

• Введение STZ привело к значительному увеличению (в 3,1 раза) экспрессии мРНК IFNγ по сравнению с контрольной группой солевого раствора.
• У мышей, предварительно обработанных параоксоном, также наблюдалось 2,4-кратное увеличение экспрессии IFNγ поджелудочной железы по сравнению с контрольными.
  • Напротив, у мышей, предварительно обработанных параоксоном, и впоследствии обработанных STZ, оказались одинаковые уровни экспрессии IFNγ с теми, кто был обработан только параоксоном (обнаруживался только у 2/6 мышей).

Экспрессию IL-1 в поджелудочной железе также оценивали в разных экспериментальных группах.

• Наивысший уровень экспрессии IL-1β наблюдался в группе солевой раствор / STZ.
• Напротив, уровни экспрессии IL-1β были значительно снижены в экспериментальных группах параоксона (2,5 раза) и параоксона / STZ (2,7 раза) по сравнению с группой солевого раствора / STZ.
• Экспрессия IL-23 поджелудочной железой почти не обнаруживалась в солевых и параоксоновых группах, была максимальной в группе солевого раствора / STZ и уменьшалась на> 50% у мышей, обработанных параоксоном / STZ, по сравнению с группой солевого раствора / STZ; однако эта разница не была статистически значимой.

Анализ экспрессии TNFα в поджелудочной железе выявил только фоновые уровни без существенных различий между экспериментальными группами.

• Более того, никакие цитокины не обнаруживаются в ткани поджелудочной железы на 10-й день после лечения STZ в любой из групп.

ИНГИБИРОВАНИЕ АХЭ С УМЕНЬШЕНИЕМ СЕЛЕЗЕНОЧНЫХ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ И Th17 ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК

• Затем исследовалось влияние ингибирования АХЭ на периферический иммунный ответ у мышей, обработанных STZ.
• Иммунофенотипирование не выявило существенных различий в процентах крупных популяций клеток селезенки среди четырех различных экспериментальных групп при введении в день 10 или 18 после обработки STZ.
  • Единственным исключением является небольшое, но значительное уменьшение частоты CD8 + Т-клеток в группе параоксона / STZ по сравнению с мышами, обработанными солевым раствором / STZ, на 10-й день после введения STZ.
• Учитывая роль IL-17 и Th17 клеток в аутоиммунном диабете и их противодействующее регулирование с помощью IFNγ, в клетках селезенки определяли уровни экспрессии мРНК IFNγ и IL-17.
• Умеренная регуляция экспрессии IFNγ наблюдалась у мышей, предварительно обработанных ингибитором АХЭ (параоксон и параоксон / STZ-группы) по сравнению с контрольной группой солевого раствора.
  • Различия были статистически значимыми между группами солевого раствора / STZ и параоксона / STZ.
• И наоборот, хотя введение STZ привело к увеличению экспрессии IL-17 в 4,7 раза по сравнению с животными из группы контрольного солевого раствора, предварительная обработка параоксоном препятствовала ответной экспрессии IL-17 (параоксон / STZ-группа).
• Эти результаты показывают, что ингибирование АХЭ привело к увеличению продукции IFN-γ и уменьшению IL-17, индуцированного STZ.
• Дальнейший анализ показал снижение экспрессии цитокинов IL-6 и IL-23, участвующих в дифференцировке клеток Th17, в группах, получавших параоксон, по сравнению с группой солевого раствора.
• По сравнению с контрольной группой животных экспрессия IL-6 повышалась в группе солевого раствора / STZ.
• С другой стороны, уровни экспрессии IL-12 – цитокина, стимулирующего выработку IFNγ, были увеличены в группах, обработанных параоксоном, по сравнению с контрольной группой солевого раствора (в 2,7 раза и 1,8 раза в группах параоксона и параоксона / STZ, соответственно).
• Значительные различия в экспрессии IL-12 наблюдались между обработанными параоксоном мышами по сравнению с группами солевого раствора или солевого раствора / STZ.
• Не наблюдалось существенных различий в экспрессии провоспалительных цитокинов TNFα и IL-1 среди экспериментальных групп.
• Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование АХЭ может предотвращать гипергликемию, индуцированную STZ, путем модуляции баланса между образованием Th1 и Th17.
• Чтобы оценить это непосредственно, определяли процент клеток Т-лимфоцитов IL-17 + и IFNγ + на 18-й день после введения STZ.
  • Стимуляция ex vivo с помощью PMA / иономицина с последующим окрашиванием внутриклеточных цитокинов показала, что предварительная обработка параоксоном вызывала умеренное увеличение процента клеток IFNγ + CD4 +.
  • В группе солевой раствор / STZ наблюдалось значительное снижение процента IFNγ + CD4 + и IFNγ + CD8 +, но повышение процента IL-17 + CD4 +, Т-клеток по сравнению с группой параоксона и параоксона / STZ.
  • Процент клеток CD4 + IL-17 + в группе солевого раствора / STZ был значительно увеличен по сравнению с группами, обработанными параоксоном (в 2,4 раза и в 2 раза по сравнению с группами параоксона и параоксона / STZ соответственно).
• Экспрессия IL-17 была обнаружена главным образом в CD4 +, но не в CD8 + Т-клетках.
• Эти результаты подтверждают идею о том, что ингибирование АХЭ приводит к преимущественной индукции Th1-ответа, который подавляет дифференцировку клеток Th17 с помощью STZ.

ИНГИБИРОВАНИЕ АХЭ НЕ ПОЗВОЛЯЕТ ПРЕДОТВРАТИТЬ STZ-ИНДУЦИРОВАННУЮ ГИПЕРГЛИКЕМИЮ У IFNγ — / — МЫШЕЙ

• Для дальнейшего выяснения роли IFNγ в развитии гипергликемии использовалась та же модель MLD-STZ, чтобы вызвать диабет у мышей IFNγ — / -.
• Введение параоксона индуцирует 50-60% ингибирование активности АХЭ, как у мышей дикого типа (ДТ) C57BL / 6, так и у IFNγ — / — мышей.
  • Важно отметить, что предварительная обработка параоксоном защищает от гипергликемии, вызванной STZ, у ДТ, но не у мышей IFNγ — / — .
• У мышей ДТ развилась гипергликемия через 7-10 дней после введения STZ, и продолжалась до 7 недель.
• Напротив, гипергликемия после инъекции STZ не наблюдалась у мышей, предварительно обработанных параоксоном.
• Интересно отметить, что предварительная обработка параоксоном мышей IFNγ — / -, по-видимому, защищала от развития гипергликемии в течение первых 10 дней после введения STZ.
• Впоследствии, однако, у мышей IFNγ — / -, предварительно обработанных параоксоном, развилась гипергликемия, и к 49 дню уровень глюкозы в крови достиг 500 мг/дл, идентичный показателям мышей, предварительно обработанных солевым раствором.
• Умеренная степень потери веса (10-15%) наблюдалась у мышей, получавших ингибиторы АХЭ, причем, как у мышей ДТ, так и у IFNγ — / -, особенно в течение 3-недельного (от дня -21 до дня 0) периода предварительной обработки параоксоном.
• После окончания периода предварительной обработки параоксоном массы животных постепенно нормализовались и к 28-му дню были идентичны массам мышей, предварительно обработанным солевым раствором.
• Поскольку у мышей ДТ развивалась гипергликемия из-за STZ, они начинали терять вес, и это было отчетливо видно на 35 день после инъекции STZ.
• Тем не менее, мыши ДТ, предварительно обработанные пароксоном, больше не теряли вес после STZ, и, по сути, их вес был выше, чем у группы солевого раствора / STZ на 35-й и 42-й день после введения STZ.
  • Хотя мыши IFNγ  — / — также восстанавливали свой первоначальный вес после лечения параоксоном, у них не наблюдалось дополнительного увеличения веса после введения STZ из-за их гипергликемического состояния.
• Также оценивалась долгосрочная выживаемость мышей, обработанных STZ (C57BL / 6 и IFNγ — / -), после предварительной обработки либо солевым раствором, либо параоксоном.
  • Независимо от лечения, смертность не была зарегистрирована у мышей C57BL / 6 до 60 дней после введения STZ.
  • Однако, только около 20% мышей IFNγ — / -, предварительно обработанных солевым раствором или параоксоном, выжили к 60-му дню после STZ. Это, скорее всего, связано с более высокими уровнями гипергликемии, наблюдаемыми у этих мышей.
• Эти данные подтверждают важную роль, которую IFNγ играет в холинергическом пути, опосредованном ингибированием развития диабета в модели MLD-STZ.

ИНГИБИРОВАНИЕ АХЭ НЕ ЗАЩИЩАЕТ ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ β-КЛЕТКИ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА У IFNγ — / — МЫШЕЙ

• Затем было проанализировано состояние клеток, продуцирующих инсулин, в ткани поджелудочной железы мышей IFNγ — / — в 10 И 18 дни после введения STZ.
• По сравнению с контрольной группой солевого раствора группа солевого раствора / STZ продемонстрировала снижение количества β-клеток, продуцирующих инсулин, на 10-й день после инъекции STZ, и это стало более выраженным на 18-й день после STZ.
• Предварительная обработка параоксоном, по-видимому, задерживала гибель β-клеток.
• У обработанных параоксоном мышей IFNγ — / — были обнаружены более высокие уровни сывороточного инсулина по сравнению с контрольной группой солевого раствора.
• Никакого снижения сывороточного инсулина не наблюдалось у мышей, получавших параоксон / STZ, в течение первых 10 дней после приема STZ (параоксон / STZ-группа).
• К 18-му дню уровень инсулина в сыворотке снизился до уровня, близкого к уровню в группе солевого раствора / STZ.
• Эти данные свидетельствуют о том, что IFNγ не играет роли в начальном контроле гипергликемии, вызванной STZ.
• Окрашивание гематоксилином и эозином ткани поджелудочной железы мышей IFNγ — / — показало сильно инфильтрированные островки в группе солевого раствора / STZ на 10-й день и 18 после введения STZ.
• Островки поджелудочной железы из группы параоксона / STZ проявили умеренную инфильтрацию на 10-й день, но на 18-й день все островки оказались инфильтрированными, хотя и в меньшей степени, чем в группе солевого раствора / STZ.
• Никакой видимой клеточной инфильтрации не наблюдалось в островках солевых или параоксоновых контрольных групп.
• Иммуногистологический анализ островков на 10 и 18 день показал наличие меньшего количества CD3 + Т-клеток, чем у мышей ДТ, причем самые высокие уровни были обнаружены в группе солевого раствора / STZ.
• Предварительная обработка параоксоном уменьшила степень инфильтрации Т-клетками более, чем на 60% (группа параоксон / STZ) по сравнению с группой солевого раствора / STZ.
• Окрашивание F4 / 80 mAb выявило аналогичную степень инфильтрации макрофагами во всех четырех экспериментальных группах.

ИНГИБИРОВАНИЕ АХЭ ПРИВОДИТ К ЧАСТИЧНОЙ МОДИФИКАЦИИ Th17 КЛЕТОК В ОТСУТСТВИЕ IFNγ

• Как и ожидалось, внутриклеточное окрашивание спленоцитов мышей IFNγ — / — не выявило CD4 + IFNγ + или CD8 + IFNγ + T клеток.
• Ингибирование АХЭ вызывало частичное, но не статистически значимое снижение процента CD4 + IL-17 + клеток (параоксоновая группа).
• Введение STZ индуцировало дифференцировку CD4 + IL-17 + клеток в группе солевого раствора / STZ (среднее ± SEM = 3,7 ± 0,2%), что представляет собой увеличение в 2,9 раза по сравнению с контрольной группой солевого раствора.
• Для мышей, обработанных параоксоном / STZ, процент клеток CD4 + IL-17 + был немного, но значимо уменьшен (2,3 ± 0,2%) по сравнению с группой солевого раствора / STZ, но все же был значительно выше, чем у ингибиторов солевого раствора и ацетилхолинэстеразы (АХЭ).
• Тем не менее, наличие значительного уровня CD4 + IL-17 + Т-клеток у обработанных параоксоном / STZ IFNγ — / — мышей резко контрастирует с результатами у мышей ДТ, где аналогичная обработка уменьшала отношение CD4 + IL-17 + Т-клетки до исходных уровней.
• Эти результаты подчеркивают иммуномодулирующий эффект холинергического пути и важную роль IFNγ в предотвращении развития STZ-индуцированного диабета.

ОБСУЖДЕНИЕ

• В нескольких исследованиях было выявлено значение парасимпатической нервной системы в регуляции иммунных реакций при инфекционных и аутоиммунных заболеваниях.
• Цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить влияние ингибирования АХЭ на начало и развитие СД1, индуцированного введением MLD-STZ.
• Холинергическую стимуляцию индуцировали за счет использования необратимого специфического ингибитора АХЭ, первичного АХ-гидролизующего фермента, что привело к увеличению уровней АХ.
• Результаты текущего исследования демонстрируют четыре основных момента.
  • Во-первых, профилактическая холинергическая стимуляция ингибирует развитие гипергликемии и СД1, опосредованные STZ.
  • Во-вторых, это достигается прямым усилением продуцирования инсулина клетками поджелудочной железы и защитой этих клеток от STZ-индуцированного аутоиммунного, цитотоксического повреждения.
  • В-третьих, АХ индуцирует MLD / STZ-триггерный сдвиг дифференцировки T-клеток от патогенных клеток Th17, секретирующих IL-17, к клеткам Th1, секретирующим IFN-γ.
  • Наконец, АХ-опосредованная защита значительно ослабляется у мышей с дефицитом синтеза IFNγ, что является убедительным доказательством важнейшей роли этого цитокина в реакции активации холинергического пути в данной аутоиммунной модели.
• Блуждающий нерв иннервирует поджелудочную железу и контролирует как эндокринную, так и экзокринную секрецию.
• Секреция АХ посредством стимуляции блуждающего нерва действует на мАх-Р, экспрессируемые на β-клетках, и активирует выработку инсулина.
• Результаты, показывающие, что ингибирование АХЭ индуцирует увеличение экспрессии мРНК поджелудочной железы, согласуются с этими предыдущими результатами.
• Индуцированное увеличение синтеза инсулина может компенсировать ущерб, вызванный STZ, и предотвратить первоначальное развитие гипергликемии.
• Более того, было показано, что лечение STZ повышало экспрессию АХЭ поджелудочной железы, что, в свою очередь, приводило к гибели островковых клеток.
• Профилактическое ингибирование АХЭ может предотвратить разрушение β-клеток STZ и сохранить продукцию инсулина.
• Недавнее исследование показало, что ингибирование АХЭ галантамином задерживало начало диабета у мышей NOD.
• Имеются предварительные доказательства того, что другие ингибиторы АХЭ, такие как галантамин и ривастигмин, также препятствуют развитию гипергликемии в модели MLD-STZ.
• Повышенная холинергическая активность при стимуляции блуждающего нерва также играет важную роль в подавлении воспаления поджелудочной железы.
  • Ранее сообщалось, что периферическое введение ингибитора АХЭ приводит к защитным противовоспалительным реакциям как на местном (слизистая оболочка), так и на системных уровнях.
  • В этом случае результаты показывают, что ингибирование АХЭ у обработанных STZ мышей приводит к снижению инфильтрации островков CD3 + Т-клетками и к значительно более низким уровням экспрессии мРНК поджелудочной железы IL-1 и селезенки IL-6 и IL-17.
  • Поэтому данные свидетельствуют о том, что активация холинергического пути влияет на развитие гипергликемии в модели MLD-STZ, действуя как на местном уровне (поджелудочная железа), так и на уровне иммунной системы.
• Первоначально IFNγ считался цитокином, отвечающим за развитие аутоиммунного диабета.
• Это мнение изменилось, когда было выяснено, что мыши NOD с дефицитом IFNγ все еще были подвержены инсулиту и диабету, хотя и с задержкой начала.
• Клетки Th-17 являются мощными индукторами аутоимунного воспаления тканей.
• Увеличение патогенных клеток Th17 и избыточное производство IL-17 играют большую роль в развитии СД1 у мышей и человека, а также в развитии других аутоимунных заболеваний.
• При STZ-индуцированном СД1 мыши с дефицитом по IL-17R или IL-17 устойчивы к STZ-индуцированному прогрессированию диабета и у них проявляются сниженные инсулит и гипергликемия, что указывает на то, что IL-17 играет патогенную роль в этой модели.
• В модели «мыши NOD» ингибирование Th17 / IL-17 подавляло развитие диабета.
• Взаимодействие между Th17 и Th1 на эффекторной фазе является критическим фактором, определяющим начало и прогрессирование заболевания.
• В настоящем исследовании показано, что ингибирование АХЭ усиливает синтез IFNγ в поджелудочной железе и селезенке и увеличивает количество IFN-положительных Th1-клеток.
• В сочетании с результатами, демонстрирующими снижение экспрессии IL-6 и IL-1β, двух цитокинов, участвующих в дифференцировке Th17 из клеток памяти, индуцированные холинергическим путем иммуномодулирующие эффекты приводили к уменьшению отношения IL-17, продуцирующегося клетками Th17, и уровня цитокинов IL-17 у обработанных мышей.
• Эти данные свидетельствуют о важной роли холинергического пути в регуляции развития аутоиммунного диабета.
• Селезенка является основным лимфоидным органом, в котором могут происходить презентация  антигена, активация Т-клеток и увеличение их клона.
• Блуждающий нерв не иннервирует селезенку напрямую.
  • Вместо этого блуждающий нерв заканчивается в брюшном ганглии, из которого выступает адренергический селезеночный нерв, иннервируя селезенку через высвобождение норадреналина.
• Внутри селезенки норадреналин воздействует на подмножество Т-клеток памяти и стимулирует высвобождение АХ из этих клеток.
• Ингибирование АХЭ уменьшало экспрессию селезеночного IL и IL-23, двух цитокинов, играющие ведущие роли в развитии Th17 и патогенности и повышающей экспрессию IL-12 и IFNγ.
• IL-12 является важным иммунорегуляторным цитокином,  мощным индуктором IFNγ и одновременно ингибитором продукции IL-6 и IL-23.
• Доказано, что IFNγ оказывает модулирующее действие на иммунные клетки, включая IL-17-продуцирующие клетки Th17.
• Развитие клеток Th17 из клеток-предшественников сильно ингибируется IFNγ и IL-4.
• Наличие более высоких уровней IFNγ в селезенке будет мешать дифференцировке Т-клеток-предшественниов в клетки Th17, уменьшая доступность патогенных клеток Th17 для миграции на поджелудочную железу.
• Результаты согласуются с более ранними исследованиями, свидетельствующими о ингибирующей роли IFNγ в развитии клеток Th17 и СД1 у мышей NOD.
• На уровне ткани-мишени (поджелудочной железы) ингибирование АХЭ приводило к уменьшению экспрессии IL-1β и IFNγ, двух провоспалительных цитокинов, которые, как известно, индуцируют апоптоз в β-клетках поджелудочной железы.
• Эти результаты подтверждают идею о том, что IFNγ при диабете может иметь двойную функцию: патогенную — на уровне поджелудочной железы и защитную — на уровне селезенки.
• В нескольких исследованиях рассматривается прямой эффект холинергической стимуляции на отдельные популяции иммунных клеток.
  • Никотин, холинергический агонист нАХ-Р, увеличивает продукцию IL-12 макрофагами и дендритными клетками (ДК) in vitro.
  • Как мАХ-Р, так и нАХ-Р экспрессируются на Т-клетках, при мускариновой стимуляции приводящей к усилению продукции IL-10 и IL-17, тогда как никотинергическая стимуляция повышает активность IFNγ и ингибирует IL-17.
  • Таким образом, холинергическая стимуляция может воздействовать непосредственно на Т-клетки, чтобы стимулировать продукцию IFNγ или опосредованно через ДК и макрофаги, увеличивая продукцию IL-12.
• Тот факт, что наблюдалось частичное восстановление экспрессирующих IL-17 CD4 + T-клеток у обработанных параоксоном / STZ IFNγ — / — мышей, предполагает, что IL-12 может регулировать активацию Th17 независимо от IFNγ.
• В дополнение к клеткам Th17 индуцированные IL-17 CD8 + T-клетки (Tc17) также индуцируются в модели диабета MLD-STZ.
• Повышенная частота клеток Tc17 проявлялась только сразу после введения STZ (6 день), но была нормализована на 11-й день после STZ.
• В текущем исследовании не удалось обнаружить какого-либо значительного увеличения Tc17-клеток в любой из экспериментальных групп, скорее всего, из-за раннего момента времени — на 10-й день после STZ.
• Тем не менее, небольшое, но значимое снижение общих CD8 + Т-клеток было отмечено на 10-й день у мышей, обработанных параоксоном / STZ, по сравнению с группой солевого раствора / STZ.
• Возможно, что введение ингибиторов АХЭ также может влиять на развитие болезни, предотвращая активацию и дифференцировку CD8 + T-клеток и клеток Tc17.
• Имеются данные, свидетельствующие о том, что IL-12 может усилить подавляющую активность триггеров, тем самым косвенно влияя на борьбу с патогенными аутоиммунными Т-клетками.
• Дальнейшие исследования необходимы для исследования точного механизма, с помощью которого ингибирование АХЭ смягчает развитие патогенных клеток Th17 при аутоиммунном диабете.
• В заключение, полученные  результаты показывают, что ингибирование АХЭ снижает частоту STZ-индуцированного СД1 и впервые дает механистические доказательства того, что это достигается за счет ингибирования патогенных клеток Th17.
• Данные демонстрируют ключевую роль IFNγ в опосредовании наблюдаемого защитного эффекта.
• В настоящее время изучается возможность модулирования тяжести заболевания путем терапевтического введения ингибиторов АХЭ.
• В совокупности эти результаты указывают на перспективную стратегию профилактики СД1 и других аутоиммунных заболеваний.

Источник:

1. George JA, Bashir G, Qureshi MM, et al. Cholinergic Stimulation Prevents the Development of Autoimmune Diabetes: Evidence for the Modulation of Th17 Effector Cells via an IFNγ-Dependent Mechanism. Frontiers in Immunology. 2016;7:419. doi:10.3389/fimmu.2016.00419.