Блокирующие антитела к рТТГ и скорость ремоделирования костной ткани у пациенток с болезнью Грейвса в перименопаузе

• Переломы, связанные с остеопорозом, являются одним из осложнений болезни Грейвса.
• Выдвинута гипотеза, что различное воздействие антител к рецепторам тиреотропного гормона (АТ — рТТГ), стимулирующих или блокирующих активность рецептора, у пациентов с болезнью Грейвса может по-разному влиять на обновление костной ткани.
• В исследование включены пациентки в менопаузе с недавно диагностированной  болезнью Грейвса  (n = 93), которые были разделены на две группы:
  • пациенты со стимулирующими АТ к рТТГ — группа стимулирующих активность (n = 83),
  • пациенты с комбинацией стимулирующих и блокрирующих АТ к рТТГ — группа блокирующих активность (n = 10).
• Пациенты из группы стимулирующих АТ, имеющие соответствующие для группы блокирующих АТ значения свободного Т4 и иммуноглобулинов, ингибирующие связывание ТТГ (TBII), были в дальнейшем классифицированы как контрольная группа для группы стимулирующих АТ(n = 11).
• В группе блокирующих АТ, чем в группе стимулирующих АТ или в контрольной группе для группы стимулирующих АТ маркеры обновления костной ткани были значительно ниже:
  • костноспецифическая щелочная фосфатаза (КС-ЩФ),
  • остеокальцин,
  • С-телопептид.
• Между уровенем TBII и уровнями КС-ЩФ и остеокальцина в группе стимулируемой активности была выявлена положительная корреляция,
  • в то время как между ним и уровнем остеокальцина в группе блокируемой активности корреляция была отрицательной.
• Активация рТТГ антителами способствует высокой скорости обновления костной ткани вне зависимости от действия гормонов щитовидной железы,
  • антитела блокирующие активность щитотвидной железы обладают защитным эффектом в отношении костного метаболизма при болезни Грейвса.

Введение

• Остеопороз — осложнение болезни Грейвса (распространенного эндокринного нарушения, поражающего 1 — 2% населения).
• Пациенты с болезнью Грейвса имеют низкую минеральную плотность костей и повышенный риск переломов.
• Гормоны щитовидной железы играют основную роль в метаболических изменениях костей у пациентов с болезнью Грейвса
  • поскольку они одновременно стимулируют активность остеокластов и остеобластов, суммарное воздействие которых приводит к уменьшению костной массы.
• Помимо эффектов тиреоидных гормонов, на костный метаболизм также предположительно влияет ТТГ.
• Определить значение влияния ТТГ на костный метаболизм независимо от тиреоидных гормонов является сложной задачей, т.к. значения ТТГ и тиреоидных гормонов связаны друг с другом по механизму гормональной обратной связи.
• Некоторые исследования субклинических состояний, при которых уровень ТТГ повышался или понижался без изменения тиреоидных гормонов, показали, что
  • уровень ТТГ имеет позитивную корреляцию с минеральной плотностью кости.
• Пациенты с дифференцированным раком щитовидной железы, получавшие высокие дозы заместительной терапии тиреоидными гормонами, приводящие к субклиническому гипертиреозу,
  • имели повышенный риск остеопороза.
• Исследование с участием голландских женщин в перименопаузе выявило, что
  • повышенный уровень тироксина в пределах нормального референсного интервала, при условии не пониженного и определяемого уровня сывороточного ТТГ, был независимо ассоциирован с низкой минеральной плотностью костей.
    • Это указывает на то, что тиреоидные гормоны с большей вероятностью, чем ТТГ играют роль в в костном метаболизме.
• С другой стороны, антитела к рТТГ могут активировать рецепторы в тироцитах схожим с ТТГ образом .
• Хотя при болезни Грейвса уровень ТТГ заметно снижен, антитела к рТТГ присутствуют в сыворотке пациентов и могут стимулировать ТТГ-сигнал клеток.
• Кроме того, после достижения ремиссии болезни Грейвса, АТ-рТТГ могут оставаться в сыворотке постоянно.
• В связи с этим, влияние рТТГ-сигнала на костный метаболизм представляет интерес с точки зрения прогнозирования долговременных клинических последствий для состояния костной ткани пациентов.
• Учитывая то, что рТТГ-сигнал имеет функциональную роль в костном метаболизме при гипертиреозе, мы предположили, что
  • различное воздействие АТ-рТТГ, стимулирующих или блокирующих активность рецепторов,  у пациентов с болезнью Грейвса может по-разному влиять на обновление костной ткани.
• Взаимоотношение между АТ-рТТГ и сывороточными маркерами ремоделирования костной ткани было проанализировано у пациентов в пременопаузе с нелеченой болезнью Грейвса.

Материалы и методы

Материалы

• Среди пациентов с недавно диагностированной болезнью Грейвса, проходивших лечение в Национальном Университетском Госпитале Сеула в период с марта по декабрь 2001 года, было выбрано 93 женщины в пременопаузе (средний возраст 33±9 лет).
• Болезнь Грейвса была диагностирована на основании симптомов и признаков гипертиреоза:
  • повышенный уровень тироксина (Т4) и/или трийодтиронина (Т3),
  • сниженный уровень ТТГ,
  • повышение захвата (>4.5%) технеция-99м при сцинтиографии.
• Пациенты, участвовавшие в исследовании, в прошлом :
  • не имели переломов,
  • не страдали какими-либо иными аутоиммунными заболеваниями,
  • не принимали добавок или лекарств, способных повлиять на костный метаболизм (кальций, витамин D, стероиды).
• Исследование было одобрено экспертным советом Национального Университетского Госпиталя Сеула.
• Устное информированное согласие было получено от каждого пациента, а формирование выборок и работа с ними проводились с использованием шифрования.
• Всем участникам были устно изложены основные положения предстоящего исследования, включая пункт об информированном согласии.
• В связи с тем, что данное исследование было проведено до вступления в силу «Bioethics and Safety Act» в Корее (24.03.2005), Независимый Этический Комитет одобрил отказ от письменной формы информированного согласия.

Классификация групп «стимулирующих АТ» и «блокирующих АТ»

• Все 93 пациентки были разделены на 2 группы, в соответствии с типом их АТ-рТТГ.
  • Пациентки, имевшие только АТ-рТТГ со стимулирующей щитовидную железу активностью сформировали группу «стимулирующих АТ» (n = 83).
  • Пациентки, у которых на основании клинической картины предполагалось наличие как АТ-рТТГ со стимулирующей активностью, так и АТ с блокирующей активностью, были названы группой «блокирующих АТ» (n = 10).
    • Эти 10 пациенток из группы блокирующих АТ имели спонтанный (идиопатический) гипотиреоз с постоянным иммуноглобулинов, ингибирующие связывание ТТГ (TBII) в течение 1-2 лет после ремиссии (Клинические характеристики отдельных пациентов из группы блокируемой активности).
• Для исключения влияния тиреоидных гормонов и титра TBII на костный метаболизм,
  • 11 пациенток из группы «стимулирующих АТ», имевшие соответствующие для 10 пациенток из группы «блокирующих АТ» значения свободного Т4 и TBII, были в дальнейшем классифицированы как соответствующая контрольная группа (n = 11).
• В дальнейшем было выявлено, что группа «блокирующих АТ» дала ранний ответ на анти-тиреоидную лекарственную терапию в сравнении с контрольной группой для «стимулирующих АТ».

Анализ на цАМФ в нормальных эпителиальных клетках щитовидной железы

• Для проверки биологического воздействия блокирующих АТ
  • нормальные эпителиальные клетки щитовидной железы H. tori, приобретенные в Корейском банке клеток (Сеул, Южная Корея) и выращенные на среде RPMI, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки,
  • были обработаны цельной сывороткой от каждой пациентки из группы «блокирующих АТ».
• Как положительный контроль в H tori клетках были использованы:
  • рекомбинантный бычий ТТГ (10 мЕд/мл, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),
  • рТТГ-стимулирующие человеческие моноклональные антитела М22 (100 нг/мл, RSR Ltd., Cardiff, UK),
  • цельная сыворотка от двух разных пациенток (#36 и 84#) из контрольной групп.
• Как отрицательный контроль в H tori клетках были использованы:
  • ТТГр-блокирующие человеческие моноклональные антитела K1-70 (100 ng/mL, RSR Ltd.).
• Спустя 1 час белки собрали и провели анализ на цАМФ в соответствии с инструкциями производителя.

Биохимия

• Образцы сыворотки получали утром натощак и немедленно обрабатывали и замораживали при температуре −70°C до момента окончания анализов.
• Уровни сывороточного ТТГ измеряли с помощью иммунорадиометрического анализа.
• Уровни свободных Т4 и Т3 измерялись с использованием радиоиммуноанализа.
• Уровни АТ-рТТГ измерялись с использованием ТСИИ исследования первого поколения.
• Сывороточные концентрации кальция, фосфора, общего белка и альбумина измерялись на химическом автоанализаторе Hitachi 7600. Скорректированный уровень кальция рассчитывался по следующей формуле: скорректированный Са = 0.8 × (4.1—альбумин пациента) + Са пациента.
• Уровень сывороточного паратгормона (ПТГ) измерялся с помощью радиоиммунометрического анализа, а уровень сывороточного 25-гидрокси-холекальциферола (25-OHD3) с помощью сверхбыстрой тандемной жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
• Уровень сывороточной костноспецифической алкалиновой фосфатазы (КС-АЛФ) измерялся ферментным иммуноанализом (референсный интервал женщин в пременопаузе: 11.6–29.6 Ед/л).
• Уровень сывороточного остеокальцина измерялся с помощью иммунорадиометрического анализа.
• Уровень сывороточного С-концевого телопептида коллагена I типа (С-телопептид) измерялся с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа (референсный интервал женщин в пременопаузе: <0.573 нг/мл, Roche, Indianapolis, IN, USA).

Статистический анализ

Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (СО), различия между группами оценивались  с помощью  студенческого t-теста. Частный коэффициент корреляции рассчитывался с помощью SPSS 20.0 («Statistical Package for the Social Sciences» — «статистический пакет для социальных наук») . Значение P < 0.05 было принято за статистически значимое.

Результаты

Сравнение биохимических параметров, связанных с метаболизмом щитовидной железы и костной ткани, между группами стимулирующих и блокирующих АТ

• Исходные клинические и биохимические характеристики принимавших участие в исследовании пациентов суммированы в Таблице 1:
  • средний возраст 33 ± 9 лет;
  • уровень свободного Т4 был равен 3.1 ± 1.8 нг/дл,
  • а средняя активность TBII равнялась 54.5 ± 24.8%.
• Для исследования влияния АТ-рТТГ на костный метаболизм пациенты были разделены на две группы на основании различной активности их АТ-рТТГ:
  • стимулирующие АТ,
  • блокирующие АТ.
• Блокирующая активность АТ-рТТГ подтверждалась с помощью анализа на цАМФ в тироцитах с использованием цельной сыворотки отдельных пациентов.
• В группе блокирующих АТ был зарегистрирован
  • меньший уровень продукции цАМФ, чем в контрольной группе (4.8±0.3 против 12.9±0.5, P = 0.001),
  • больший, чем при применении моноклональных блокирующих антител K1-70 (4.8±0.3 vs 2.6±0.3, P<0.001).
• В группе блокирующих АТ в сравнении с группой стимулирующих АТ:
  • средний диагностический возраст и уровень TBII выше,
  •  средний уровень свободного Т4 ниже (Таблица 1).
• И в группе стимулирующих АТ, и в группе блокирующих АТ в пределах нормы и без значимых различий между группами были параметры, связанные с костным метаболизмом:
  • уровень кальция,
  • фосфора,
  • 25-OHD3,
  • ПТГ.
• Однако, в сравнении с референсным интервалом, уровень маркера образования костной ткани КС-ЩФ был выше у всех пациенток с болезнью Грейвса.
• Кроме того, уровень КС-ЩФ был значительно выше в группе стимулирующих АТ, чем в группе блокирующих (58.2 ± 27.2 vs. 41.7 ± 15.8, P = 0.034; Таблица 1).
• Уровни остеокальцина и С-телопептида превышали референсный интервал в группе стимулирующих АТ, но не в группе блокирующих.

Таблица 1

Клинические характеристики и сывороточные параметры, связанные с костным метаболизмом пациентов

• Для исключения влияния тиреоидных гормонов и титра TBII на костный метаболизм, было отобрано 11 пациенток из группы «стимулирующих АТ», которые имели соответствующие для 10 пациенток группы «блокирующих АТ» значения свободного Т4 и TBII и определили их как контрольную группу.
• В контрольной группе по сравнению с группой «блокирующей активности» были значительно выше сывороточные маркеры ремоделирования костной ткани:
  • КС-ЩФ,
  • остеокальцин
  • С-телопептид.
• Анализ окончательных результатов показал, в группе «стимулирующих АТ» было много пациенток с фенотипом, характеризующимся высокой интенсивностью обновления костной ткани,
  • а в группе блокирующих АТ такие фенотипы встречались реже.

Взаимосвязь между активностью АТ-рТТГ и маркерами обновления костной ткани

Взаимосвязь между уровнем активности АТ-рТТГ и концентрацией маркеров обновления костной ткани:

• в группе стимулирующих АТ
  • выявлена положительная корреляция между активностью TBII и уровнями КС-АЛФ (γ = 0.252, P =004) и остеокальцина (γ = 0.241, P = 0.006) после корректировки по возрасту, а также уровнями св. Т3 и Т4;
  • отмечена положительная корреляция между сывороточным С-телопептидом и TBII в группе стимулирующий АТ, не значимая статистически (γ = 0.139, P = 0.120).
• в группе блокирующих АТ
  • выявлена незначительная тенденция к отрицательной корреляции между активностью  TBII и С-телопептидом (γ = −0.541, P = 0.086);
  • сильная отрицательная корреляция с остеокальцином (γ = −0.722, P = 0.043), но не с сывороточнымм С-телопептидом (γ = −0.405, P =320).

• Совокупность этих данных говорит о том, что рТТГ-сигнал имеет свою функциональную роль в костном метаболизме,
  • а присутствие блокирующих АТ негативно сказывается на ремоделировании костной ткани.

Обсуждение

• Настоящее исследование дало оценку влияния рТТГ-сигнала на костный метаболизм у нелеченых пациентов с гипертиреозом.
• Среди 93 пациентов, 10 пациентов имели как стимулирующие, так и блокирующие активность щитовидной железы антитела (группа блокирующих АТ), в то время как другие имели только АТ со стимулирующей активностью (группа стимулирующих АТ).
• Присутствие блокирующих стимуляцию щитовидной железы антител ослабило обновление костной ткани при гипертиреозе.
• Выявлена отрицательная корреляция между уровнем TBII и сывороточным остеокальцином в группе блокирующих АТ,
  • в то время как между ним и уровнями КС-ЩФ и остеокальцина в группе стимулирующих АТ корреляция была положительной.
    • Эти данные говорят о том, что независимо от влияния тиреоидных гормонов, активация рТТГ антителами может играть самостоятельную роль в костном метаболизме при болезни Грейвса.
• Это первое указание на разнонаправленное влияние разных типов АТ-рТТГ на костный метаболизм.
• Могут ли АТ-рТТГ самостоятельно влиять на костный метаболизм пока до конца не ясно.
• Касательно влияния ТТГ, выдвинута гипотезу о том, что
  • ТТГ обладает самостоятельным влиянием на процесс ремоделирования костей.
  • В одном исследовании ТТГ подавлял одновременно остеобластогенез и остеокластогенез,
    • а у нокаутных мышей, у которых отсутствовали рТТГ, была выявлена заметная потеря костной массы и фентотип, характеризующийся высокой скоростью ремоделирования костной ткани, что говорит о негативном воздействии ТТГ на костный метаболизм.
• Схожее воздействие ТТГ приводит к различным вариантам костного фенотипа в зависимости от патофизиологического состояния.
  • У грызуновс овариэктомией прерывистое введение ТТГ  приводило к антирезорбтивному и анаболическому ответу на фоне острого недостатка эстрогенов.
  • При гипертиреозе у мышей с недостатком рТТГ выявлялась усиленная резорбция костной ткани и серьезная потеря ее массы в сравнении с обычными мышами, что позволяет сделать предположение о защитном воздействии ТТГ при гипертиреоз-ассоциированном остеопорозе.
• Совокупность этих данных, указывает на то, что ТТГ может снижать интенсивность обновления костной ткани, регулируя процессы ее резорбции и синтеза, что не согласуется с результатами настоящего исследования.
  • Одно из возможных объяснений этого заключается в том, что блокирующая активность антител может отличаться от таковой у генномодифицированных моделей без рецепторов ТТГ.
  • Более того, воздействия ТТГ-сигнала могут отличаться в зависимости от различных состояний, таких как эстрогенная недостаточность, кроме того, прямое сопоставление биологических систем мыши и человека также вносит свои ограничения.
• С другой стороны, было показано, что ТТГ оказывает стандартное влияние на дифференцировку остеобластов in vitro.
  • Hyt/hyt мыши, имевшие приводящую к снижению функции мутацию рТТГ, продемонстрировали нормальное развитие скелета, что указывает на незначительную роль влияния ТТГ на рост костей.
• Несмотря на то, что влияние рТТГ-сигнала на костный метаболизм не сопоставимо с влиянием тиреоидных гормонов, определение его самостоятельной роли в костном обмене, особенно при гипертиреозе, все еще остается важной задачей.
• Остеопороз и связанные с ним переломы является одним из главных долгосрочных осложнений болезни Грейвса.
• Масштабное популяционное исследование выявило, что отношение шансов перелома бедра остается увеличенным спустя более чем 10 лет после постановки диагноза гипертиреоза.
• Учитывая то, что у значительной части пациентов после достижения ремиссии все еще имеются ТТГ стимулирующие антитела, можно предположить, что
  • сигнал активированных рТТГ  играет свою роль в гипертиреоз-ассоциированной болезни костей;
  • известно, что уровень ТТГ-стимулирующих антител имеет
    • положительную корреляцию с уровнями маркеров ремоделирования костной ткани,
    • отрицательную — с минеральной плотностью костей.
• Целью настоящего исследования было прояснить функциональную роль опосредованного через антитела рТТГ-сигнала в костном метаболизме.
• Установлено, что два различных вида АТ-рТТГ оказывают противоположное влияние на костный метаболизм.
• Клинически, АТ-рТТГ делятся на два типа:
  • антитела, стимулирующие щитовидную железы, которые имитируют действие ТТГ, что приводит к развитию аутоиммунного гипертиреоза, в том числе болезни Грейвса,
  • антитела, блокирующие стимуляцию щитовидной железы, которые блокируют связующее сродство ТТГ к рТТГ, что приводит к аутоиммунному гипотиреозу.
• Несмотря на то, что блокирующие антитела обнаруживаются преимущественно у пациентов, страдающих аутоиммунным гипотиреозом, они также встречаются в сочетании со стимулирующими антителами у небольшого числа пациентов с болезнью Грейвса.
• Наличие блокирующих антител в подгруппе пациентов с болезнью Грейвса может быть причиной обнаруженных в этой подгруппе значительных колебаний уровня тиреоидных гормонов.
• В ходе настоящей работы исследовалась подгруппа пациентов с болезнью Грейвса, у которых можно было предположить наличие блокирующих стимуляцию щитовидной железы антител, основываясь на
  • значительных колебаниях уровня тиреоидных гормонов,
  • клиническом исходе в спонтанный гипотиреоз.
    • Подтверждено, что эти пациенты имеют относительно низкую интенсивность обновления костной ткани, в сравнении с другими пациентами с болезнью Грейвса.
• Более того, в группе блокирующих АТ была зафиксирована отрицательная корреляция между титром АТ-рТТГ и уровнями маркеров обновления костной ткани.
  • Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что ТТГ-сигнал играет самостоятельную роль в изменении костного метаболизма при болезни Грейвса.
• К сожалению, молекулярные характеристики антител, блокирующих стимуляцию щитовидной железы, не были подтверждены непосредственным измерением в этом исследовании.
  • В настоящее время не существует прямого метода, позволяющего измерить активность антител, блокирующих стимуляцию щитовидной железы, в отдельности от стимулирующих антител.
  • Был использован метод превращения in vitro c FRTL-5 клетками, являющися непрямым.
• В связи с тем, что антитела, блокирующие стимуляцию щитовидной железы могут быть использованы не только для прогнозирования клинических исходов болезни Грейвса, но и для того, чтобы сделать предположение о состоянии костей, необходимы дальнейшие исследования по разработке новых биоанализов для определения наличия блокирующих стимуляцию щитовидной железы антител среди превосходящего множества антител стимулирующих.

Ключевым выводом настоящего исследования является то, что блокирующие антитела ослабляют ускоренное обновление костной ткани при гипертиреозе.

• Уровни маркеров обновления костной ткани, такие как КС-ЩФ, остеокальцин и С-телопептид выше пределов нормы в группе стимулирующих АТ, но ниже в группе блокирующих АТ.
• В группе блокирующих АТ выявлена отрицательная корреляция между TBII (%) и маркерами обновления костной ткани,
  • в то время как в группе стимулирующих АТ эта корреляция носила обратный характер.
• Хотя изменение уровней КС-ЩФ (γ = -0.632, P = 0.093) и C-телопептида (γ = -0.405, P = 0.320) не было статистически значимым, отрицательная тенденция была зафиксирована.
  • Отсутствие статистической значимости возможно обусловлено малым размером выборки.
• Эти результаты согласуются с недавно проведенным в Германии популяционном когортном исследовании, выявившем значительную положительную корреляцию между уровнем ТТГ и маркерами обновления костной ткани:
  • включая N-концевой пропептид проколлагена I типа,
  • КС-ЩФ,
  • остеокальцин,
  • С-телопептид.

Настоящее исследование имело некоторые ограничения в изучении роли опосредованного через антитела рТТГ-сигнала в костном метаболизме.

• Из-за отсутствия оценки костной массы, не сделаны выводы о влиянии АТ-рТТГ на ремоделирование костей.
• Кроме того, в этом исследовании не подвергались оценке имеющие отношение к состоянию костей клинические параметры, такие как масса тела пациента.

В будущем необходимо проведение хорошо спланированного исследования для точной оценки влияния опосредованного через антитела рТТГ-сигнала у пациентов с болезнью Грейвса в сочетании с костной патологией.

Активация рТТГ  опосредованным через антитела ТТГ-сигналом способствует высокой интенсивности обновления костной ткани, а антитела, блокирующие стимуляцию щитовидной железы, оказывают защитное воздействие на костный метаболизм при болезни Грейвса.

 Источники:

1. Cho SW, Bae JH, Noh GW, et al. The Presence of Thyroid-Stimulation Blocking Antibody Prevents High Bone Turnover in Untreated Premenopausal Patients with Graves’ Disease. Kim J-E, ed. PLoS ONE. 2015;10(12):e0144599. doi:10.1371/journal.pone.0144599.