Влияние синдрома обструктивного апноэ сна разной степени тяжести на длину теломер

Ведение

• Синдром обструктивного апноэ сна (СОАС) — нарушение сна, характеризующееся
  • повторяющимися эпизодами остановки дыхания во сне (апноэ) или
  • частичной обструкцией верхних дыхательных путей (гипопноэ).
• Отмечается:
  • уменьшение насыщения крови кислородом,
  • храп,
  • беспокойный ночной сон,
  • дневная сонливость.
• Известно, что СОАС стимулирует
  • развитие окислительного стресса,
  • активирует симпатическую нервную систему,
  • приводит к эндотелиальной дисфункции.
• Эти мезанизмы и обусловливают формирование фрагментированного сна и интермиттирующей гипоксии.

Основные механизмы  СОАС способствуют обострению воспаления и окислительного стресса в дыхательных путях.

Интермиттирующая гипоксия приводит к

• рецидивирующей  кислородной десатурации,
• изменению количества  кислорода во многих тканях,
  • что приводит к увеличению провоспалительных цитокинов и дисбалансу между прооксидантной и антиоксидантной системами в результате избыточной продукции активных форм кислорода (АФК).

Аналогичным образом, фрагментация сна способствует увеличению экспрессии и активации никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН) оксидазы, фермента, считающегося  основным источником активных форм кислорода при СОАС.

Накопление окислительных повреждений происходит в результате того, что активные формы кислорода оказывают влияние на  жизненно важные биомолекулы. На клеточном уровне, АФК приводят  к разрывам двунитевой ДНК и укорочению теломер, что является важным триггером клеточного старения.

• Теломеры характеризуются наличием тандемных повторов  некодирующей ДНК (TTAGGG/ CCCTAA) на концах хромосом и отвечают за защиту и стабилизацию концевых отделов  хромосом, во избежание потери у ДНК кодирующей функции или хромосомной нестабильности.
• Длина теломер имеет тенденцию к укорочению с течением времени, в основном за счет так называемых  «проблем репликации концов», либо из–за других причин,  таких как
  • окислительный стресс,
  • генетические факторы,
  • коморбидность.
• Теломеры являются маркерами биологического старения, поскольку их длина, как правило, сокращается  с возрастом и их укорочение  приводит к более высокому риску смертности.
• Длинные теломеры ассоциируются с более поздним старением,
  • в то время как короткие теломеры обычно встречаются при ряде патологических состояний в роли индикаторов начала болезни и отражают ее исход.

Учитывая тот факт, что важным модулятором поддержания теломер является окислительный стресс и что теломер-управляемое репликативное старение является в первую очередь реакцией на стресс, это указывает на потенциальную связь между СОАС и клеточным старением за счет укорочения теломер.

• Таким образом, ученые предположили, что СОАС может быть связан с более короткими теломерами по сравнению с контрольной группой лиц без СОАС.
• Кроме того, попытались оценить различия в средней длине теломер лейкоцитов (ДТЛ)  у людей с легкой, средней  и тяжелой степенью СОАС, а также выяснить, существует ли зависимость между параметрами сна и ДТЛ.

Материалы и методы

Протокол исследования

• Это часть перекрестного исследования, которая называется Эпидемиологические Исследования Сна в Сан-Паулу, она основывается на опросе населения, в котором 1042 участникам проведена полисомнография, исследованы их анкеты сна и образцы крови.
• Для того, чтобы выборка жителей Сан-Паулу в 2007 году была репрезентативной по данным пола, возраста (20-80 лет) и социально-экономического класса, была применена трехступенчатая вероятностная кластерная модель выборки.
• Протокол исследования был одобрен Комитетом по вопросам этики для научных исследований из федерального университета Сан-Паулу (CEP 0593/06) и зарегистрирован с ClinicalTrials.gov (number: NCT00596713; name: Epidemiology of sleep disturbances among adult population of the Sao Paulo City).
• Всеми участниками до их включения в исследование было подписано информированное добровольное согласие.

Оценка полисомнографии

• В течение ночи в лаборатории сна с помощью система EMBLA® N7000 (Embla Systems Inc., USA)  участникам исследования проводили полисомнографию.
• Стадии сна были обработаны обученными специалистами  в соответствии со стандартизированными критериями для исследования  сна.
• Процедуры  были запланированы в зависимости от наличия добровольцев, чтобы попытаться соответствовать  их привычному  графику сна, который был оценен в течение собеседования во время первого визита.
• Физиологические параметры, оцениваемые  в ходе полисомнографии, включали:
  • электроэнцефалограмму (4 канала: С3-А2, С4-А1, О1-А2, О2-А1);
  • электроокулограмму (2 канала: ЭОК-лево-А2, ЭОГ-право-А1);
  • поверхностную электромиограмму (4 канала: субментальная и жевательная области, передняя большеберцовая мышцы и седьмое межреберье);
  • ЭКГ (1 канал: модифицированное отклонение V1);
  • поток воздуха (2 канала: термопара и назальное давление);
  • дыхательное усилие (2 канала: грудь и живот) на основании  плетизмографии;
  • храп и положение тела (1 канал) с ЭМБЛА® датчиков;
  • степень насыщения крови кислородом – сатурация (SpO2) через ЭМБЛА® оксиметр, который позволяет измерить средний и минимальный уровень SpO2,  один раз базальный, когда пациент проснулся,  и дважды, когда пациент спит.
• Ученые использовали Руководство Американской Академии медицины сна по оценке сна и связанных с ним событий.
• Гипопноэ фиксировались в соответствии со следующим правилом: уменьшение потока дыхания на 50%, связанное с пробуждением или понижение насыщения крови кислородом на 3%.
• Индекс десатурации — число случаев понижения насыщения крови кислородом на 3% в час сна.
• Индекс дыхательных нарушений — общее количество обструктивных дыхательных параметров (апноэ, гипопноэ и связанных с дыхательными усилиями пробуждениями).

Диагноз синдрома обструктивного апноэ сна

• Это  исследование включало  лиц с СОАС и контрольную группу.
• В соответствии с Международной классификацией расстройств сна (2005), СОАС регистрировался, когда индекс апноэ/гипопноэ (ИАГ) у людей был от 5 до 14,9, и имелся хотя бы один из следующих симптомов:
  • громкий храп,
  • дневная сонливость,
  • усталость,
  • остановки дыхания во сне.
• У лиц с ИАГ от 15 диагностировался СОАС, независимо от наличия вышеперечисленных симптомов.
• Определение степени тяжести СОАС основывалось на ИАГ.
• Таким образом выделено 3 степени:
  • легкая (5 ≤ ИАГ < 15),
  • средняя (15 ≤ ИАГ < 30),
  • тяжелая (ИАГ ≥ 30).
• Лица, которые не подошли под критерии  СОАС были рассмотрены как контрольная группа.

Измерение длины теломер лейкоцитов

• На утро после полисомнографии, все добровольцы сдали 10 мл крови, которую собрали  в  пробирки с ЭДТА для экстракции ДНК.
• ДНК выделяли согласно протоколу Миллера с соавторами.
• После выделения, образцы ДНК подсчитывали и разбавляли до 50 нг/мкл.
• Измерение длины теломер проводилось методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.
• Измерение заключается в определении относительного соотношения Т/S — нг теломер (T) к нг альбумина (single-copy gene, S) в экспериментальных образцах с использованием стандартной кривой.
• Отношение Т/S пропорционально средней длине теломер.

Были проанализированы в общей сложности 928 образца.

• Не подошло 114 образцов из-за недостаточной концентрации (17 образцов),
• недостаточного объема (37 образцов),
• отказа некоторых участников полностью заполнить данные анкеты (60 образцов).

Условия ПЦР амплификации:

• 15 минут при 95°С, 2 цикла по 15 секунд при 94°с, 15 секунд при 49°с, 35 циклов по 15 секунд при 94°с, 10 секунд при 68°С и 15 секунд при 74°C с приобретением флуоресценции (обнаружение амплификации теломер), 10 секунд при 85°С, 15 секунд при 88°C с приобретением флуоресценции (обнаружение амплификации альбумина) и кривой плавления.

Статистический анализ

• Нормальное распределение было проверено тестом Колмогорова-Смирнова.
• Все переменные, не имеющие нормального распределения, были стандартизированы на сновании  Z-счета, прежде чем перейти к независимому Т-тесту на простые сравнения между СОАС и контрольной группой.
• Критерий хи-квадрат использовался для проверки возможных связей между категориальными переменными, и, следовательно, для  определения смешанных факторов.
• Корреляция между ДТЛ (отношение Т/S) и полисомнографическими параметрами была оценена с помощью коэффициента корреляции Спирмена.
• Кроме того, сравнение ДТЛ между СОАС и контрольной группой было выполнено с использованием анализа ковариации (ANCOVA), и скорректировано  с учетом возраста, массы тела и пола.
• Наконец, для того чтобы определить влияние степени тяжести СОАС  (на основании  ИАГ) на ДТЛ, использовали обобщенную линейную модель (GLzMM)  с гамма-распределением по полу, возрасту, индексу массы тела, образованию, наличию диабета, перенесенного инсульта и инфаркта, как независимые переменные и отношение Т/S как зависимую переменную.
• Для отношения Т/S поэтапно была  построена линейная регрессионная модель.
• Были рассмотрены независимые переменные: возраст, пол, ИМТ, ИАГ, эффективность сна, показатель пробуждения и средний уровень SpO2.
• Мера эффекта длины теломер была посчитана с помощью формулы Коэна (D). Статистическая значимость равна 5%.

Результаты

• В исследование были включены   613 пациентов, составивших контрольную группу и 315 с СОАС,
  • в которой 48,6% страдали легкой степенью ночного апноэ (от 5 до 15 апноэ/гипопноэ в час),
  • 31,1% средней степенью (от 15 до 30 апноэ/гипопноэ в час) и
  • 20,3% тяжелой степенью (больше 30 апноэ/гипопноэ в час).
• Как и ожидалось, пациенты в группе с СОАС были
  • старше (t = -13,9, df  = 926, р < 0,001),
  • преобладали лица мужского пола (χ2 = 25,872, df  = 1, р < 0,001),
  • с более высоким ИМТ (t  = -11,8,  df  = 926, р < 0.0019),
  • индексом дыхательных расстройств (ИДР) (t  = -21,4,  df  = 918, п < 0.001),
  • индексом апноэ/гипопноэ  (t  = -27,4, df = 926, р < 0,001),
  • индексом десатурации (t  = -18,5, df  = 769, р < 0,001),
  • латентностью фазы быстрого сна (t  = -3,318,  df  = 917, р = 0,001),
  • процентом Н1 (t  = -4,420,  df  = 926, р < 0,001), Н2 (t  = -3,084,  df  = 926, р= 0,002), Н3 (t  = 3,889, df  = 926, р < 0,001),
  • преобладали  частые пробуждения после начала сна (t  = -5,450, df  = 926, р < 0,001),
  • минимальное общее время сна (t  = 3,245, df  = 926, р < 0,001),
  • низкая эффективность сна  (t  = 5,023,  df   = 926, р < 0,001),
  • низкий базальный, средний и минимальный уровень SpO2 (t  = 12,8, df  = 925, р < 0,001; t  = 13,9, df   = 926, р < 0,001; t  = 21,5,  df  = 926, р < 0,001, соответственно) по сравнению с контрольной группой.

• Кроме того, СОАС чаще развивается у людей с сахарным  диабетом (χ2 = 25,977, df = 3, р < 0,001).
• Однако  между  перенесенным инфарктом и инсультом никакой существенной связи с СОАС не наблюдалось (χ2 = 3,30, df = 2, р = 0,201; χ2 = 1,181, df = 2, р = 0,554; соответственно), а также никаких значительных различий в продолжительности обучения (t = 1,297, df = 922, п = 0,195), латентности сна (t = -1,062, df = 926, р = 0,289) и количества фаз быстрого сна (t = 1,767, df = 926, р = 0,07) между группами обнаружено не было.

График 1: средняя длина теломер выражается отношением Т/S в контрольной группе и у пациентов с СОАС  после учета  возраста, пола, ИМТ.

*  p < 0.001 по сравнению с контрольной группой

На графике 1 показано сравнение установленной ДТЛ  с поправкой на вмешивающиеся факторы у лиц с СОАС и контрольной группой.

• Предполагается, что у людей с СОАС  длина теломер лейкоцитов более короткая (mean = 1,32,  SD = 0,22), чем в контрольной группе (mean = 1,39, SD = 0,24) (F = 27,010, SD = 4, р < 0,001).
• Обобщенная линейная модель показала, что у пациентов с СОАС (n = 315) степень тяжести синдрома  (по  индексу апноэ/гипопноэ) была связана с длиной теломер даже после учета пола, возраста, ИМТ, продолжительности обучения, наличия  диабета, перенесенного инсульта и инфаркта (B = 0,055; CI = 0,007-0,102; p = 0,02).
• Ретроспективный анализ показал, что пациенты с легкой степенью СОАС имели более длинные теломеры (mean = 1,36, SD = 0,23), чем пациенты с тяжелым течением СОАС (mean = 1,25, SD = 0,16).
• Кроме того, пациенты с легкой степенью СОАС также имели более длинные теломеры, чем пациенты с СОАС средней тяжести (средний = 1,28, SD = 0,20) (p= 0,02).
• Однако между средней и тяжелой степенями СОАС никаких существенных различий в ДТЛ не наблюдалось. С учетом ковариат были рассчитаны средние прогнозируемые значения, как показано на графике 2.

График 2: средние прогнозируемые значения длины теломер лейкоцитов с поправкой  ковариаты  (пол, возраст, образование, ИМТ, диабет, инсульт и инфаркт) при различной степени тяжести  СОАС в соответствии с индексом апноэ/гипопноэ;   5 < ИАГ < 15 (легкая степень тяжести)

• Для решения значимости выводов, относительно  разницы в длине теломер в соответствии с возрастом и ИАГ была рассчитана  мера эффекта Коэна (d).
• Между возрастными группами 20-29 лет и 30-40 лет  мера эффекта найденная по отношению к  ДТЛ составила 0,17.
• Между контрольной группой и пациентами с СОАС легкой степени тяжести (5 ≤ ИАГ< 15) мера эффекта составила  -0,09; между контрольной группой  и пациентами с СОАС средней степени тяжести (15 ≤ ИАГ < 30) она была 0,17; и между контрольной группой и пациентами с СОАС тяжелой степени тяжести (ИАГ ≥ 30)  0,21. 

Результаты показывают отрицательную взаимосвязь между ДТЛ оцененных по среднему отношению  Т/S и следующим параметрам:

• индекс апноэ/гипопноэ,
• индекс дыхательных расстройств,
• индекс десатурации,
• индекс пробуждения и микропробуждения (активация).

ДТЛ положительно коррелирует с такими параметрами как

• общее время сна,
• эффективность сна,
• базальный, минимальные и средний уровень SpO2.

Никакой корреляции  не наблюдались между ДТЛ и такими параметрами как латентность сна, латентность быстрой фазы сна, показателями Н1, Н2, Н3 и быстрого сна и быстрой фазой сна.

Результаты показали, что возраст (β = 0,26, t = -7,46, р < 0,00) и средний уровень  SpO2 (β = 0,08, t = 2,32, р = 0,02) были предикторами длины теломер в модели, что объясняется 98%  вариабельности Т/S. Переменными включенными в модель были: пол, ИМТ, ИАГ, эффективность сна и индекса пробуждения.

Обсуждение

• Данное исследование показало, что СОАС связан с уменьшением ДТЛ по сравнению с пациентами контрольной группы в эпидемиологической выборке из Сан-Паулу.
• Также установлено, что ДТЛ была связна  с фрагментацией сна и параметрами гипоксии – средний уровень SpO2 — один из самых важных предикторов ДТЛ, после возраста.
• Хотя данные из литературы и раньше указывали  на связь между нарушениям дыхания во сне и ДТЛ, данное исследование описало взаимосвязь между ДТЛ и основными патофизиологическими параметрами СОАС с использованием объективных методов в репрезентативной выборке населения. Barcelo и коллеги (2010) также описали укорочение длины теломер лейкоцитов у пациентов с СОАС по сравнению с контрольной группой, даже после учета потенциально вмешивающихся факторов.
  • Однако  не была прослежена взаимосвязь между степенью тяжести СОАС и длинной теломер лейкоцитов.
• Savolainen и соавт. (2014) в перекрестном  исследовании изучали  может ли  СОАС или первичной храп иметь связь  с ДТЛ.
  • Участники с возможным  СОАС имели более короткую ДТЛ , чем в контрольной группе, в то время как у людей с первичным храпом ДТЛ не отличалась от контрольной группы, поэтому предполагается, что укороченная ДТЛ может быть определенным фактором риска СОАС.
• Kim и соавт. (2010) в исследовании взаимосвязи между длиной теломер и СОАС у детей наблюдали, в отличие ожидаемого результата , что дети с СОАС имели  увеличение ДТЛ по сравнению с контрольной группой.
  • Для того, чтобы объяснить эти данные, авторы предположили, что СОАС может вызывать раннюю мобилизацию мезенхимальных стволовых клеток и что это может играть роль защитного эффекта у ребенка с гипоксией или активированными медиаторами воспаления.
  • Кроме того, у пациентов с СОАС лимфоциты находятся в очень активном состоянии и тот факт, что эти клетки могут экспрессировать теломеразы может объяснить сохранение ДТЛ у детей с СОАС. Кроме того, возраст участников и субъективные инструменты, используемые для описания СОАС в этом исследовании, могут помочь объяснить найденные  несоответствия.

По результатам многофакторного анализа, отмечено, что гипоксия является наиболее важным фактором СОАС, ассоциированным с длиной теломер в репрезентативной выборке, средний уровень SpO2 оставался значимым после учета вмешивающихся факторов, в отличие от переменных, связанных с фрагментацией сна, таких как  показатель пробуждения и  эффективность сна.

• В соответствии с результатами данного исследования, Boyer  с коллегами (2016) наблюдал в выборке среднего возраста мужчин, что периодическая гипоксия, через индекс десатурации кислорода, вносит существенный вклад в укорочение теломер, даже с учетом вмешивающихся факторов.
• Аналогично,  Choi и его коллеги обнаружили, что ОАС имел статистически значимую связь с короткой длиной теломер, увеличивая риск изменения  белого вещества в головном мозге в обществе на основе когорты пожилых людей.

В отношении продолжительности сна, данные литературы свидетельствуют, что короткая продолжительность сна связана с более короткой ДТЛ.

• Однако, к такому толкованию следует подходить с определенной осторожностью, поскольку эти исследования оценивали ДТЛ и сон у людей разного пола, возраста и состояния здоровья.
• Кроме того, эти исследования основывались на анкетах-опросниках оценки продолжительности сна и качества сна, что может повлиять на качество данных.
• Используя данные, полученные при помощи полисомнографии, была обнаружена отрицательная корреляция между ДТЛ и индексом пробуждения и пробуждениями после начала сна.
• Напротив, наблюдалась положительная корреляция между ДТЛ и эффективностью сна, а также общим временем сна. Эти результаты подтверждают связь между укорочением сна и уменьшением ДТЛ и показывают, что продолжительность сна может также играть роль в укорочении ДТЛ.

Известно, что длинные теломеры связаны с уменьшением старения, но длинные теломеры связаны также с некоторыми видами рака.

• Уже установлено, что  ДТЛ уменьшается в процессе старения и с возрастными заболеваниями, которые  могут  ускорять этот процесс. Более того, совокупные уровни окислительного стресса и воспаления также могут влиять на длину теломер.
• В настоящем исследовании, обнаружено, что ДТЛ была короче у лиц с СОАС, чем в контрольной группе.
• Также существует корреляция между параметрами сна. В отличие от других, в этом исследовании отражено взаимодействие степени тяжести СОАС  с ДТЛ.

Несмотря на то, что данное исследование является перекрестным и, таким образом,  не может быть выведена причинность, найденные данные могут побудить будущие проспективные и экспериментальные исследования с целью обеспечения возможных молекулярных путей, лежащих в основе взаимосвязи  между СОАС и ДТЛ, независимо от старения.

• Можно утверждать, что возможный механизм опирается на каскад событий, связанных с прерывистой гипоксией/фрагментацией  сна, приводя к увеличению продукции АФК и провоспалительных цитокинов, которые являются факторами, способными укорачивать теломеры.

Это исследование имеет некоторые ограничения.

• Перекрестный дизайн не позволяет выявить причинность, только ассоциации.
• Во-вторых, отсутствуют ночные адаптации для полисомнографии.
• В-третьих, известно, что длина теломер и их реакции на стрессы зависит от ткани, т. е. в короткоживущих клетках этот процесс  может быть более выражены  из-за генетических факторов, тогда как в долгоживущих клетках  других тканей он может быть более выражен из-за влияния сопутствующих заболеваний, таких как СОАС.

Таким образом, в настоящем исследовании длина теломер измерялась в лейкоцитах (короткоживущие клетки) по этическим причинам, мы можем предположить, что результаты могли бы быть более точными, если были бы выбраны  другие клетки-мишени.

В заключение, это исследование указывает на наличие взаимосвязи между ДТЛ и СОАС и значительном влиянии степени тяжести СОАС на укорочение теломер.

• В отношении СОАС-сопутствующих факторов, хотя и качество сна и его продолжительность являются  важными, гипоксия вносит более значительный вклад в ускорение укорочения теломер.
• Таким образом, настоящее исследование поддерживает идею о возможной связи между патофизиологией СОАС и молекулярными путями клеточного старения, связанными с поддержанием длины теломер.
• Чтобы установить, есть ли причинно-следственная связь между СОАС и укорочением теломер, и понять их возможные механизмы, необходимо проведение проспективных и экспериментальных исследований.

Источник:

1. The effect of the severity of obstructive sleep apnea syndrome on telomere length. Tempaku PF, Mazzotti DR, Hirotsu C, Andersen ML, Xavier G, Maurya PK, Rizzo LB, Brietzke E, Belangero SI, Bittencourt L, Tufik S Oncotarget. 2016 Oct 25;7(43):69216-69224. doi: 10.18632/oncotarget.12293.