Изменение уровня инсулина при внутривенном введении грелина и влечение к спиртному у лиц, злоупотребляющих алкоголем

 ВВЕДЕНИЕ

• Все в большем количестве исследований сообщается о важной роли путей, регулирующих аппетит, в развитии различных зависимостей.
  • В частности, большое внимание привлекает потенциальная роль грелина в развитии алкоголизма.

Грелин, 28-аминокислотный пептид, образуется преимущественно в желудке и играет важную роль в стимуляции аппетита, потреблении пищи и формировании чувства удовлетворенности.

• Также грелин играет важную роль в поисковом поведении в отношении алкоголя у грызунов.
• Продолжительные клинические исследования выявили наличие положительной корреляции между содержанием грелина в крови, влечением к алкоголю и риском рецидивов у пациентов, страдающих алкогольной зависимостью.
• Недавно было установлено, что грелин участвует и в формировании тяги к алкоголю у лиц с тяжелым алкоголизмом: в исследовании было продемонстрировано, что внутривенное введение грелина усиливает событийно-опосредованное влечение к спиртному.

Кроме того, были проведены доклинические и клинические исследования по изучению гормона лептина при алкогольной зависимости.

• Было установлено, что лептин обладает противоположным грелину действием: снижает аппетит и вызывает чувство удовлетворения.
• Был описан своеобразный «диалог» между двумя этими гормонами в формировании аппетита и чувства насыщения.

Инсулин представляет собой пептид, состоящий из 51 аминокислотного остатка, секретирующийся b-клетками поджелудочной железы. С-пептид — это фрагмент, состоящий из 31 аминокислоты, который удаляется из проинсулина.

• Было высказано предположение о том, что грелин может влиять на формирование нарушений функционирования b-клеток (последние экспрессируют в том числе и рецепторы к грелину).
• В то же время, данные, описывающие роль грелина в секреции инсулина, разнятся.
  • Так, например, эндогенный грелин влияет на островковые b-клетки поджелудочной железы через кальциевые каскады и ограничивает индуцируемый глюкозой выброс инсулина.
  • Введение же грелина извне снижает секреторную функцию b-клеток в животных моделях как in vitro, так и in vivo.
  • Однако, грелин усиливает секрецию инсулина клетками поджелудочной железы крысы, инкубированных в среде с глюкозой.
  • Также грелин усиливал секрецию инсулина поджелудочной железой как у здоровых крыс, так и у крыс с сахарным диабетом.
• Влияние грелина на секрецию инсулина у людей еще не было до конца изучено, а имеющиеся на текущий момент данные противоречивы и ограничиваются информацией, полученной на здоровых волонтерах.
  • Так, значительное снижение концентрации инсулина в плазме крови было продемонстрировано после внутривенного введения грелина 11 здоровым волонтерам, что, однако, не удалось повторить в аналогичном исследовании.
  • Недавнее исследование 12 здоровых волонтеров также продемонстрировало, что внутривенное введение грелина ингибирует индуцированную глюкозой секрецию инсулина.
• Доклинические исследования доказали роль инсулина в допамин-зависимом пути формирования чувства удовлетворения.
• У людей умеренное употребление алкоголя способно снижать риск развития диабета, в то время как злоупотребление спиртным ассоциировано с более высокими значениями гликемии, что в свою очередь повышает риск развития СД.
• У людей, имеющих алкогольную зависимость, наблюдается значительная положительная корреляция между концентрациями инсулина, С-пептида и употреблением алкоголя.

Целью настоящего исследования являлось изучение влияния внутривенного назначения грелина на уровень гликемии у нелеченных пациентов, страдающих алкоголизмом.

• Основанная на предыдущем эксперименте со здоровыми волонтерами, гипотеза заключалась в том, что внутривенное введение грелина должно быстро снизить уровень инсулина в плазме крови.
• Также было изучено влияние грелин-индуцированного изменения концентрации инсулина в плазме на тягу к алкоголю, так как ранее было показано наличие связи между уровнем инсулина плазмы и тягой к алкоголю у зависимых лиц.
• Так как инсулин и С-пептид синтезируются и секретируются вместе бета-клетками поджелудочной железы, измерялась также и концентрация С-пептида, чтобы верифицировать измерения уровня инсулина. Согласно гипотезе, изменения концентраций инсулина и С-пептида должны быть сонаправлены.
• Чтобы выяснить, влияет ли грелин только на уровень инсулина или его воздействие распространяется и на иные гормоны, регулирующие метаболизм глюкозы, измеряли также концентрацию глюкагона, глюкагоноподобного пептида (ГПП-1) и гастроингибирующего пептида (ГИП).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Постановка эксперимента

• Исследование проводилось в Brown University Center for Alcohol and Addiction Studies, Providence, RI и было одобрено локальным этическим комитетом.
• Использование синтетического человеческого грелина было одобрено FDA (IND # 109,242).
• Все участники подписали информированное согласие перед участием в исследовании.

Результаты предыдущего исследования

Ранее было проведено двойное слепое, плацебо-контролируемое, рандомизированное, проверяющее концепцию исследование на людях (ClinicalTrial.gov: NCT01190085).

• Участники проходили скрининг на наличие алкогольной зависимости согласно диагностическому и статистическому руководству по психическим расстройствам IV издания (DSM-IV).
  • Согласно рекомендациям NIAAA, тяжелая зависимость определялась как потребление в среднем ≥4 стандартных дринков в день для женщин и ≥5 – для мужчин в течение 90 дней до скрининга (с использованием Timeline Follow-Back).
• Пациенты с диабетом или ожирением (ИМТ >30 кг/м²) были исключены из исследования.
• 45 тяжело пьющих пациентов с выраженной алкогольной зависимостью, не проходившие лечения, были случайным образом разделены на три группы.
• После получения отрицательного дыхательного теста на алкоголь, в неведущую руку устанавливалась внутривенная канюля.
• Чтобы избежать значительной индивидуальной вариабельности в базальных уровнях грелина и других гормонов, всем пациентам до исследования был предложен стандартный легкий завтрак ( 700кДж, приблизительно 62% углеводов, 13% белка, 25% жиров).
• Спустя 30 минут после употребления завтрака, проводилось внутривенное введение грелина в течение 10 минут в дозе 3 мкг/кг, 1 мкг/кг или 0 мгк/кг (группа плацебо).
• Затем участники проходили процедуру определения стимул-реактивности, в ходе которой им представлялось две серии тестов.
  • Каждая из серий включала в себя нейтральный, возбуждающий аппетит объект (сок) и алкоголь-содержащую жидкость.
  • Сила желания употребить сок или спиртное определялась по соответствующим визуальным аналоговым шкалам.
• В этом исследовании было показано, что грелин в дозе 3 мкг/кг усиливал тягу к алкогольным стимулам по сравнению с группой плацебо (р < 0,05).
• Также была обнаружена значительная положительная корреляция между постинфузионной концентрацией грелина в плазме и возрастанием тяги к употреблению алкоголя (р < 0,05).
• В экспериментах с соком аналогичных результатов получено не было (р > 0,05).

Анализ проб крови

• Грелин или плацебо вводились внутривенно болюсно в течение 10 минут. Образцы крови для анализа забирались в следующих временных точках:
  • базальной (-15 мин),
  • после пробы с соком (+23 мин),
  • после пробы с алкоголем (+ 29 мин),
  • постэкспериментально (+48 мин).
• Образцы центрифугировались и хранились при -80°С.
• Концентрации инсулина, С-пептида, глюкагона, ГПП-1 и ГИП определялись с использованием флуоресцентного Bio-Plex анализа (Bio-Rad, Hercules, CA).

Анализ данных

• В соответствии с предыдущим исследованием, две группы, получавшие внутривенно грелин (в дозе 1 мкг/кг и 3 мгк/кг) были объединены.
  • Их сравнивали с группой плацебо.
• Также, рассматривались только образцы, взятые в начальной точке (-15 минут), во время второй пробы с соком и алкоголем ( +23 и +29 минут) и в конце эксперимента (+48 минут).
  • Фактически, в соответствии с ранее проведенными исследованиями, процедура оценки стимул-реактивности продемонстрировала, что вызванная тяга к употреблению алкоголя сильнее именно во время второй пробы.
• Полученные значения концентрации гормонов в сыворотке были нормализованы, что позволило устранить индивидуальную и половую вариабельность параметров.
• Вариабельность оценивалась как отклонения от начальной точки и выражалась в средних и стандартных отклонениях.
• Кривая концентрации инсулина имела слегка ассиметричный и эксцесс, из-за чего было применено log-преобразование, позволившее улучшить свойства распределения.
• Были включены все доступные точки в пределах стандартизованных кривых.
• Использованный статистический метод заключался в повторном ANOVA-анализе.
• Величина отличия (D) от базального уровня использовалась для оценки потенциальной взаимосвязи с изменениями по визуальным аналоговым шкалам, для оценки применялся коэффициент корреляции Пирсона.
• Этот анализ проводился только для гормонов, чей уровень значимо менялся после введения грелина.
• Все статистические тесты были двусторонними, уровень значимости был принят за р<0,05.
• Для произведения расчетов использовался пакет программ SPSS v.22 (Armonk, NY), для построения графиков — GraphPad Prism v.5 (La Jolla, CA).

РЕЗУЛЬТАТЫ 

Описание выборки

• Значения сывороточного уровня инсулина двух участников исследования сильно отклонялись от стандартной кривой и поэтому они были исключены из исследования.
• Таким образом, была сформирована выборка из 43 пациентов.
• В предыдущем исследовании не было значимых отличий между группами ни по демографическим показателям, ни по базальным концентрациям грелина.
• Взаимосвязи между ИМТ и базальными концентрациями инсулина, С-пептида, глюкагона, ГПП-1 и ГИП в плазме обнаружено не было (р >0,05).

Эндогенные концентрации сывороточного инсулина и С-пептида после внутривенного введения грелина

• Значения концентраций инсулина в двух группах (грелин и плацебо) были нормализованы, подвергнуты log-трансформации для формирования нормального распределения и оценены с точки зрения отличия от базального уровня.
  • Основным эффектом от в/в введения грелина по сравнению с плацебо оказалось снижение сывороточной концентрации инсулина (F_1,42 = 4,15, p<0,05).
• Также были нормализованы и оценены концентрации С-пептида.
  • Была установлена тенденция, согласно которой в/в введение грелина способно снижать концентрацию С-пептида (F_1,36 = 3,34, p=0,076).
• Для обоих случаев был продемонстрирован временной эффект грелина ( р<0,001).

Эндогенные концентрации сывороточного глюкагона, ГПП-1 и ГИП после внутривенного введения грелина

• Полученные значения сывороточного глюкагона, ГПП-1 и ГИП были нормализованы, изучались отличия концентраций от базального уровня.
• Значимый временной эффект был показан только для глюкагона (р<0,001), в остальных случаях грелин не оказывал статистически значимого влияния.

Связь между сывороточной концентрацией инсулина и тягой к употреблению сока или алкоголя

• Никакой значимой корреляции между отличиями концентрации инсулина от базальной и изменением тяги к употреблению сока или алкоголя установлено не было (Ps >0,05).

Взаимосвязь между концентрациями грелина и инсулина в сыворотке

• Было установлено наличие отрицательной корреляции между сывороточными концентрациями грелина и инсулина во время пробы с алкоголем (r= -0,33, р<0,05).

Взаимосвязь между сывороточными концентрациями инсулина и лептина после в/в введения грелина

• В предыдущей работе (Haass-Koffler et al., 2015) было показано, что грелин по сравнению с плацебо значительно снижал концентрации эндогенного лептина.
• Основываясь на данных о том, что в/в назначение грелина снижает концентрацию эндогенного инсулина и о наличие обратной корреляции между концентрациями инсулина и грелина, проанализировали и данные о концентрациях лептина.
• Этот дополнительный анализ также показал наличие значительной отрицательной корреляции между сывороточной концентрацией грелина и лептина во время пробы с алкоголем ((r₃₆=-0,36, р<0,05).
• Финальным этапом исследования была оценка потенциальной взаимосвязи между концентрациями инсулина и лептина во время пробы с алкоголем, однако, наличие этой связи установить не удалось (р>0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

• В данном исследовании, согласно предложенной гипотезе, в/в назначение грелина значительно снижало сывороточную концентрацию инсулина по сравнению с плацебо.
  • Это исследование – первое, в котором было изучено влияние грелина на концентрацию инсулина у пациентов, страдающих алкоголизмом.
• В предыдущих исследованиях было показано, что в/в назначение грелина снижает сывороточную концентрацию инсулина.
  • Тем не менее, указанная работа была проведена на здоровых добровольцах, в то время как в данной работе изучались пациенты с тяжелым алкоголизмом, группа людей, часто страдающих различными метаболическими нарушениями.
  • Так как из исследования исключили пациентов с ожирением (то есть с ИМТ >30) и/или диабетиков, было важно установить, распространяются ли данные, полученные на здоровых добровольцах, на эту выборку.
  • Хотя уровень гликемии в ходе исследования не измерялся, можно предположить, что на фоне снижения концентрации инсулина содержание глюкозы, наоборот, вырастало.
• Целью фармакологического этапа с применением грелина было подтвердить усиление тяги к алкоголю.
  • Также, назначение грелина усиливает поисковое поведение в отношении алкоголя у грызунов, что было показано многими независимыми лабораториями (Leggio, 2010; Engel and Jerlhag, 2014).
• Таким образом, можно предположить, что гипергликемия (включающая в себя, но не ограничивающаяся гипергрелинемией) может быть связана с усилением тяги к употреблению спиртного у пациентов с алкоголизмом.
  • Ранее было показано что уровень гликемии положительно коррелирует с частотой употребления спиртного у таких больных.

Тем не менее, это заключение является спекулятивным и не подтверждено экспериментально, так как изучались только острые эффекты от введения грелина, также полученные данные не могут быть экстраполированы на хроническую гипергрелинемию при алкоголизме.

• Также, важно отметить, что полученные данные позволяют предположить наличие специфического влияния грелина на концентрацию инсулина (конкретно, в снижении концентрации инсулина и C-пептида).
• Получить аналогичные данные для глюкагона, ГПП-1 или ГИП не удалось. Причина, по которой изменение концентрации С-пептида (в отличие от инсулина) не приняло статистически значимого размера может крыться в краткости инфузии грелина и большем периоде полужизни С-пептида (около 30 минут).
  • Таким образом, концентрации С-пептида могли изменяться не так быстро, как концентрации инсулина после введения грелина.
• Предыдущее исследование (Leggio et al., 2014) продемонстрировало, что в/в введение грелина снижает острую стимул-опосредованную тягу к алкоголю.
• В ходе эксперимента также была обнаружена положительная корреляция между постинфузионной концентрацией грелина и усилением тяги к алкоголю.
• В данной работе грелин снижал концентрацию инсулина, но это снижение концентрации инсулина не коррелировало с усилением тяги к спиртному.
  • Эти результаты противоречат ранее опубликованным данным.
• В данном исследовании, в/в введение грелина остро снижало сывороточную концентрацию лептина, а изменения в концентрации лептина обратно влияли на тягу к алкоголю.
• Другими словами, введение грелина снижало как концентрацию лептина, так и концентрацию инсулина, а постинфузионная концентрация грелина отрицательно коррелировала с уровнями обоих гормонов.
• В то же время, корреляция между концентрацией гормона и тягой к алкоголю была продемонстрирована только для лептина, тем не менее, взаимосвязи между концентрациями инсулина и лептина обнаружено не было.
• Также снижение концентрации инсулина не коррелировало со снижением концентрации лептина, что дополнительно наводит на мысль об исключительном влиянии грелина на уровень инсулинемии и о том, что концентрации лептина и инсулина у пациентов с алкоголизмом изменяются не так же, как у здоровых людей.

Полученные результаты основаны на корреляционном анализе и не способны установить причинно-следственные связи.

• Также необходимо добавить, что в данном случае взаимосвязь голодания и концентрацией инсулина сама по себе не изучалась, исследовались изменения концентрации инсулина в ответ на введение грелина.
• Таким образом, эти данные не могут быть распространены на иные группы пациентов. Также, по сравнению с предыдущими работами, исследователи использовали иной метод оценки голодания (в режиме реального времени, а не постфактум).

Однако, у данного исследования есть сильные стороны.

• Во-первых, это первое исследование, в котором на пациентах с алкоголизмом было показано снижение концентрации инсулина в ответ на введение грелина.
• Во-вторых, взаимодействия инсулина и грелина были строго оценены в стандартизованном окружении (в режиме реального времени).
• В-третьих, доза грелина подбиралась в соответствии с весом пациента.
• В-четвертых, для снижения значения индивидуальной вариабельности все данные были нормализованы.

Ограничениями данного исследования являются отсутствие измерения уровня гликемии во время эксперимента, небольшая выборка и быстрое введение грелина.

• Также как ограничение может рассматриваться то, что пробы с соком и алкоголем всегда проходили в определенной последовательности.
• В то же время, эта строгая очередность помогла более строго оценивать результаты.
• Наконец, в дальнейших исследованиях вместо визуальных аналоговых шкал планируется использовать опросники тяги к алкоголю для установления различных фенотипов пациентов с алкоголизмом.

Несмотря на описанные ограничения, исследование предоставляет важную новую информацию как первое исследование на пациентах с алкоголизмом, изучающее взаимоотношения грелина и инсулина в их организме.

Источник:

1. Haass-Koffler CL, Giovenco DE, Lee MR, et al. Serum Insulin Levels Are Reduced by Intravenous Ghrelin Administration but Do Not Correlate with Alcohol Craving in Alcohol-Dependent Individuals. International Journal of Neuropsychopharmacology. 2016;19(10):pyw048. doi:10.1093/ijnp/pyw048.