Антидепрессивный эффект пиоглитазона при хроническом стрессе

  • Большое депрессивное расстройство (БДР) одно из самых часто встречающихся психических расстройств с высоким уровнем смертности.
  • В настоящее время основные препараты для лечения депрессии – это  ингибиторы моноаминоксидазы (иМАО), селективные ингибиторы обратного захвата серотонина и трициклические антидепрессанты.
  • Клинические данные показали, что эти препараты вызывают устойчивую ремиссию депрессивной симптоматики в 2/3 случаев.
  • Все больше доказательств  указывает на то, что депрессия сопровождается воспалительной реакцией.
    • Недавнее исследование сообщает, что дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов играет важную роль в развитии депрессии, связанной с хроническим стрессом (CMS-депрессии).
    • Исследование роли нейровоспалительных ответов позволило по-новому взглянуть на этиологию БДР и разработать  новую  стратегию антидепрессивной терапии.

Микроглия представлена иммунными клетками в центральной нервной системы (ЦНС) и играет ведущую роль в нейровоспалительном  ответе.

  • Микроглия активируется в ответ на травмы головного мозга и инфекционное поражение.
  • В клинических исследованиях активация микроглии также наблюдалась у пациентов с депрессией, совершивших самоубийство.
  • Активация микроглии часто делится на классическую (М1) и альтернативную (М2).
    • М1 микроглия может способствовать дисфункции нейротрофических систем, вырабатывая  провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухолей-α (ФНО), ИЛ-1β, ИЛ-6 и др.
      • В М1 микроглии происходит активация ядерного фактора kB (NF-kB), который может сыграть решающую роль в продукции провоспалительных цитокинов, что приводит к нейротоксическим  последствиям.
    • М2, нейропротекторный  фенотип  микроглии, продуцирует различные медиаторы, в том числе Ym1, ИЛ-4, ИЛ-10 и TGF-ß , способные противостоять повреждению ЦНС, связанному с воспалением.
  • Стресс провоцирует нейровоспалительные процессы в различных участках головного мозга, в том числе в лобных долях, гипоталамусе и гиппокампе.

Пиоглитазон - высоко селективный агонист PPARy, который вызывает активацию транскрипции ряда генов, вовлеченных в углеводный и липидный обмен, а также пиоглитазон связан с синтезом медиаторов воспаления.

  • Агонисты PPARy могут оказаться полезными при ряде заболеваний центральной нервной системы.
  • Пиоглитазон - это сахароснижающий препарат, однако недавно он был использован в нескольких исследованиях, посвященных лечению психических и нейродегенеративных заболеваний.
    • Пиоглитазон повышает когнитивные и функции при шизофрении и аутизме.
    • Пиоглитазон также испытывается при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянном склерозе и инсульте.
    • В клинических испытаниях, пиоглитазон использовался как вспомогательное средство для лечения депрессии у пациентов с инсулинрезистентностью.

В данном исследовании оценивались антидепрессивные эффекты агониста PPARy пиоглитазона при CMS-депрессии на модели мышей, была проанализирована роль М2 микроглии в антидепрессивной активности пиоглитазона.

Материалы и методы

Животные

  • Самцы мышей c57bl/6 весом 18-22 г были приобретены в Институте экспериментальных животных.
  • Животные были размещены по-отдельности, в контролируемых условиях (23-25 °С, влажность 50-60 %, 12-часовой световой день (с 8:00 утра), достаточное количество воды и пищи) и акклиматизированы в течении 1 недели.

Процедура CMS

Стресс вызывался с помощью:

  • лишения еды в течение 24 ч
  • лишения воды в течение 24 ч
  • изменения наклона клетки (на 45°) в течение 24 ч
  • влажной подстилкой на 24 ч
  • стробоскопическим освещением в течение 24 ч
  • ночной подсветки,
  • ограничением движения на  2 часа.

Мыши получали один стресс-фактор один раз в день.

  • Режим стресса  длился шесть недель подряд.

Контрольная группа была размещена отдельно и не имела контактов с животными, испытывающими стресс.

После 3 недель  CMS,  мыши, подвергшиеся стрессорному воздействию, были разделены на две группы, одна из которых получала медикаментозное лечение.

Медикаментозное лечение

  • Депрессивное поведение появилось  после 3 недель индукции стрессовых факторов.
  • После 3 недель индукции стресса лекарственный препарат вводили внутрижелудочно один раз в день в течение еще 3 недель.
  • Чтобы определить оптимальную дозировку, для эксперимента 1, мыши были разделены на шесть экспериментальных групп:
    • контрольная (n = 26),
    • группа, испытавшая CMS:
      • CMS группа не получавшая пиоглитазон,  n = 26,
      • CMS группа, получавшая пиоглитазон в дозе 2,5 мг/кг, n = 26,
      • CMS группа, получавшая пиоглитазон в дозе 5 мг/кг, n = 26,
      • CMS группа, получавшая пиоглитазон в дозе 10 мг/кг, n = 26,
      • CMS группа, получавшая пиоглитазон в дозе 20 мг/кг, n = 26.

В эксперименте 1, вес тела и тест на предпочтение сахарозы оценивались в одной и той же группе из 10 особей. Тест подвешивания за хвост (tst) и двигательную активность оценивали у одних и тех же животных (n = 8). Тест принудительного плавания (fst) проводился в шести группах (n=8).

Для того, чтобы понять  возможную причастность PPARy путей, в эксперименте 2 мышей разделили на пять экспериментальных групп:

  • контрольная (n=26),
  • CMS группа, получавшая 0,9 % физ. раствор, n=26,
  • CMS + Piog (CMS группа, получавшая пиоглитазон в дозе 2,5 мг/кг, n=26),
  • CMS + GW (CMS группа, которым в течение 1 часа вводился GW, специфический ингибитор  PPARy, в дозе 1 мг/кг, n=26),
  • CMS +Piog + GW (CMS группа, получавшая пиоглитазон в дозе 2,5 мг/кг и GW в дозе в 1 мг/кг, n=26).

В эксперименте 2, вес тела и тест на предпочтение сахарозы оценивались в одной и той же группе из 10 особей. TST и двигательная активность были оценены на одних и тех же мышах (n=8). FST была оценена в пять группа животных (n=8).

Иммунофлюоресцентное исследование выполнялось для определения фенотипа микроглии в контрольной (n=5), CMS  (n=5), CMS + Piog (n=5), CMS + GW (n=5), и CMS + Piog + GW (n=5) группе животных.

Измерение веса тела (ВТ) и тест на предпочтение сахарозы (ПС)

  • В качестве основных показателей оценки веса тела и ангедонии в животной модели депрессии, вес тела и тест на предпочтение сахарозы проводился перед индукцией CMS и каждую неделю до конца 6-недельного теста на CMS.
  • Вес тела измеряли один раз в неделю в 17:00 по понедельникам и рассчитывали коэффициент усиления веса тела во время кластерного периода.
  • Измерение ВТ и тест ПС назначали всем мышам.

Перед испытанием ПС, индивидуально размещенных мышей приучали потреблять 1% раствора сахарозы.

  • Тест заключался в 20 ч лишения еды и воды, с последующим потреблением 1% раствора сахарозы и воды в течение 2 ч.
  • Положение двух бутылок (с левой и правой стороны клетки) варьировалось случайным образом в каждом испытании.
  • Потребление раствора сахарозы и воды фиксировались каждую неделю в 17:00 по вторникам в течение 6 недель на протяжении всего эксперимента CMS для оценки ангедонии у мышей.
  • В ПС была рассчитана в соответствии с соотношением: ПС=потребление сахарозы(г)/[ потребление сахарозы(г) + потребление воды (г)].

Измерение двигательной активности

  • Для измерения двигательной деятельности мышей использовался 36-точечный инфракрасный луч пассивной сенсорной системы на шестой неделе эксперимента, то есть в конце испытания.
  • Каждая из мышей была помещена в автономное устройство движения за 1 мин до начала испытания.
  • Общая двигательная активность (остановка и движение) мышей автоматически записывалась  в течение 10 мин.

Тест подвешивания за хвост

  • В этом испытании, которое также проводилось один раз для всех мышей на шестой неделе эксперимента, использовалась клейкая лента, чтобы зафиксировать мышей за хвост на 20 см выступе столешницы.
  • Каждое животное  было  изолировано, чтобы избежать помех во время эксперимента.
  • Тест записывался на видеокамеру.
  • Неподвижность определялось как отсутствие движения за 6 минут и использовалась в качестве доказательства депрессии.

Тест принудительного плавания

  • Использовался метод, описанный Порсолту,  с небольшой модификацией.
  • Мышей помещали в открытый стеклянный цилиндрический контейнер (20 см в высоту и 14 см в диаметре) с глубиной воды 10 см (25±1°С) в течение 6 минут.
  • Этот тест также проводился один раз для всех мышей на шестой неделе эксперимента.
  • Продолжительность неподвижности в последние 4 мин из 6 мин фиксировалось в качестве доказательства депрессии.

Иммунофлюоресценция

  • Положительные клетки были пересчитаны вручную под ×40 увеличением.
  • Микрофотографии были сохранены как файлы TIF и количественно проанализированы.

Культура клеток

  • N9 клетки микроголии культивировали на среде с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 100 U/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в увлажненной атмосфере с 5 % СО2 и 95 % кислорода при 37 °С.
  • Клетки пересеивали два-три раза в неделю, а затем распределяли в 24-луночные планшеты.
  • Культивируемые клетки N9 были  с или без липополисахарида (ЛПС - для имитации воспаления), пиоглитазона, и GW9662.
  • Концентрации были следующими:
    • ЛПС: 100 нг/мл,
    • пиоглитазон: 10 мкмоль,
    • GW9662: 1 мкмоль.
  • После культивирования в течение 24 ч, клетки использовали для ПЦР, ИФА и вестерн-блот обнаружения.

ИФА

  • N9 клетки обрабатывали и центрифугировали (12,000 оборотов в мин в течение 5 мин).
  • Они  были собраны для определения уровней белка методом ИФА и вестерн-блот.
  • Экспрессия ИЛ-1β и ФНО-α определялись с помощью ИФА-наборов.

Вестерн-блот анализ

  • Концентрацию белка определяли с помощью BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, China) набора.
  • Кроме того проводилась количественная оценка интенсивности сигнала.

ПЦР в реальном времени

  • Мышей убивали путем декапитации, гиппокамп быстро иссекали и помещали в стерильные пробирки.
  • РНК в гиппокампе и N9 клетки собирали с использованием реагента Тризол  по инструкции производителя.
  • Синтезировали комплиментарную нить ДНК.
  • Амплификацию ПЦР проводили в 10 мкл реакционной громкости.
  • ПЦР проводили при 95 °C в течение 10 мин, затем 38 циклов 95 °C в течение 3 с, 60 °C в течение 30с,  и 72 °C в течение 5 сек.
  • Относительная экспрессия генов была рассчитана с помощью метода СT.

Результаты

Влияние различных доз пиоглитазона на лечение CMS  мышей

  • Экспериментальная модель представлена на рис. 1А.
  • Не было никаких различий в весе тела и ПС между шестью группами при исходных измерениях (р>0,05).
  • Вес тела CMS мышей постепенно увеличивался по сравнению с контрольной группой на протяжении 3 недель процедуры.
  • После 3 недель непрерывного лечение пиоглитазоном у CMS мышей, в дозах 2,5 и 5,0 мг/кг  было отмечено снижение массы тела (p<0,01 и p <0,05 соответственно; рис. 1B).
  • Сокращение относительного потребления сахарозы (ангедония) наблюдалась у мышей после 3-недельного периода CMS.
    • Состояние  ангедонии уменьшилось после 2,5 и 5,0 мг/кг (р<0,01, рис. 1D,Е).
  • За 6 недели CMS индукции время неподвижности увеличилось.
  • За три недели лечения  пиоглитазоном в дозе 2,5, 5,0 и 10 мг/кг значительно уменьшилась продолжительность неподвижности по сравнению с группой, не получавшей лечения (р<0,01; рис. 1F).
  • Спонтанный уровень активности увеличился у получающих пиоглитазон в дозе 2,5, 5,0 и 10 мг/кг по сравнению с группами без лечения.
  • Антидепрессивный эффект был наибольшим при дозе 2,5 мг/кг пиоглитазона.

Влияние пиоглитазона на поведение мышей, подвергшихся стрессу

Как показано на рис. 2А, GW9662 использовался для подавления активности PPARy.

  • Базовые показатели ВТ и ПС не отличались между пятью группами (р>0,05. рис. 2B,D), CMS-индукция уменьшает ВТ и ПС к 6 неделе по сравнению с контрольной группой.
  • GW9662 усугубило потерю веса и ангедонию после CMS (р<0,01, р<0,05; рис. 2В,Е).
  • У мышей, получавших пиоглитазон и GW9662 в группах CMS также снизился ВТ, но не СП по сравнению с CMS.
  • Мышей после CMS индукции показали снижение локомоторных движений в течение 6 недель стресса по сравнению с контрольной группой.
  • Пиоглитазон увеличивает  продолжительность  самопроизвольных движений через 3 недели, тогда как GW9662 вызывает снижение спонтанного уровня активности по сравнению с группой CMS + Piog (р < 0,05).
  • Пиоглитазон и GW9662 в сочетании не существенно изменили эффект CMS (рис. 2F).
  • После введения антагониста PPARy  GW9662 время неподвижности увеличилось по сравнению с контрольной группой мышей (р < 0,05; рис. 2G).

Влияние активности PPARy на микроглию

  • После 6 недель CMS индукции, морфология Iba1+ микроглии была амебовидная (рис. 3А), ее количество увеличилось в гиппокампе CMS мышей по сравнению с контрольными животными (рис. 3B).
  • Количество Iba1+ микроглии у мышей, подвергшихся CMS было ниже у животных, которые получали агонист PPARy пиоглитазон.
  • GW9662 и пиоглитазон при совместном назначении не изменили количество или морфологию Iba1+ микроглии.

Изучался активированный фенотип микроглии в гиппокампе.

  • Экспрессия маркеров М1 (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО, iNOS, и CCL2) увеличилась в группе CMS.
  • После лечения пиоглитазоном экспрессия маркеров М1 снизилась.
  • Пиоглитазон и GW9662 не изменили состояние активации микроглии у CMS животных (рис. 4A: р = 0,018; рис. 4B: р = 0,051; рис.4С: р = 0,045; рис. 4D: р = 0,008; рис. 4E: р = 0,032).
  • При фенотипе M2 экспрессия Ym1, Арг-1, ИЛ-4, ИЛ-10 и TGF-ß была ниже после 6-недельной индукции CMS.
  • Это снижение было уменьшено с применением пиоглитазона (рис. 5А: р = 0,001; рис. 5В: р = 0,004; рис. 5С: р = 0,001; рис. 5D: р = 0,037; рис. 5E: р = 0,046).

Влияние пиоглитазона на ЛПС-стимулированный N9 фенотип микроглии in vitro.

  • Для того, чтобы подтвердить влияние пиоглитазона на фенотип микроглии, исследовалась активность микроглии с помощью ЛПС (для имитации воспалительного процесса  организма в среде в микроглии линии N9).
  • Как показано на рис. 6 у фенотипа М1 экспрессия ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО, iNOS и CCL2 заметно увеличилась в группе ЛПС по сравнению с контрольной группой, CMS+Piog, и CMS+GW.
  • Пиоглитазон блокировал  повышенную  экспрессию этих маркеров.
  • Совместное назначение пиоглитазона и GW9662 не показало никакой разницы в ЛПС микроглии (рис. 6А: р = 0,025; рис. 6В: р = 0,023; рис. 6С: р = 0,001; рис. 6D: р = 0,001; рис. 6Е: р = 0,036).
  • В отличие от этого, экспрессия маркеров М2 (Ym1, Арг1, ИЛ-4, ИЛ-10 и TGF-ß), снижается после обработки ЛПС, но улучшается  после лечения пиоглитазоном.
  • Уровни белка противовоспалительных М2 медиаторов (Ym1 и Арг-1) также были снижены при стимуляции ЛПС, и это снижение было уменьшено пиоглитазоном.
  • Нет никакой разницы между ЛПС и ЛПС+Piog+GW микроглии в экспрессии белков  (рис. 7G: р = 0,041; рис. 7I: р = 0,026).

Далее исследовалось, может ли пиоглитазон оказывать  противовоспалительные эффекты за счет регулирования NFkB. После обработки ЛПС, уровень IkBa в N9 микроглии снизился  по сравнению с контрольными  группами.

Обсуждение

  • В этом исследовании изучался антидепрессивный эффект пиоглитазона и его противовоспалительные свойства.
  • Установлено, что во-первых, пиоглитазон облегчает состояние при депрессии на модели CMS-мышей, но это улучшение могло быть уменьшено введением GW9662.
  • Во-вторых, пиоглитазон, оказывает антидепрессивное действие за счет противовоспалительного действия (путь PPARy).
  • В-третьих, пиоглитазон уменьшает индуцированное депрессивно-подобное поведение.

Накопленные данные свидетельствуют, что хроническое воспаление играет важную роль в патогенезе депрессии.

  • Было замечено, что пиоглитазон, в качестве противовоспалительного агента, может обладать  антидепрессивным эффектом  у пациентов с сопутствующими метаболическим синдромом и сахарным диабетом.
  • В данном исследовании проведена оценка антидепрессивной эффективности пиоглитазона.
  • В ходе исследования выяснено, что пиоглитазон обладает терапевтическим действием при CMS-индуцированном депрессивно-подобном поведении.
  • Происходило  снижение двигательной активности у животных. Пиоглитазон усиливал спонтанную двигательную активность у CMS-подопытных животных, без влияния на двигательную активность у здоровых мышей.
  • Наиболее эффективными дозами для облегчения симптомов  депрессии были  2,5 и 5,0 мг/кг, дозировка 2,5 мг/кг была более эффективной.
  • Дозировки 10 и 20 мг/кг не были эффективны для CMS мышей.
  • В результате доза 2,5 мг/кг была выбрана для лечения CMS мышей в последующих экспериментах.

PPARy-это лиганд-зависимый фактор транскрипции, вовлеченный в дифференцировку адипоцитов, чувствительный к инсулину и воспалительным процессам.

  • Активация PPARy  снижает интенсивность нейровоспаления.
  • В свете противовоспалительной и нейропротекторной деятельности PPARy-зависимого сигнального пути, исследовался антидепрессивный эффект пиоглитазона на модели CMS-мышей.
  • GW9662, селективный антагонист для PPARy, вводили в этом исследовании для того, чтобы понять возможную роль активации PPARy путей на антидепрессивные свойства пиоглитазона.
  • GW9662 нейтрализует активирующее влияние пиоглитазона на PPARy.
  • Эти результаты позволяют предположить, что пиоглитазон проявляет антидепрессант-подобные эффекты, по крайней мере частично из-за активации PPARy пути.

Микроглия играет важную роль в воспалении ЦНС.

  • Роль микроглии уже давно известна  для  некоторых нейродегенеративных заболеваний.
  • По данным исследований in vitro, микроглия и ее состояние играют важную роль в  возникновении депрессии.
  • Эти данные показали, что иммунная система вовлечена в формирование моделей депрессии, что может быть обусловлено активацией микроглии М1.
  • Морфология активированной микроглии была описана в предыдущих экспериментах.
  • Установлено, что маркеры М1 (ИЛ-1β, ИЛ-6, Фно-а, iNOC и CCL2) индуцировались, а М2 маркеры (Ym1, Арг1, ИЛ-4, ИЛ-10 и TGF-ß) были снижены при депрессии.
  • Пиоглитазон восстановил равновесие М1 и М2 микроглии в гиппокампе CMS мышей.
  • Гиппокамп участвовал в снижении реакции на стресс и в регуляции эмоциональных состояний и эмоционального поведения.
  • В этом эксперименте обнаружено, что пиоглитазон может контролировать активацию микроглии и нейровоспаления при CMS-индуцированной депрессии.
  • Эти данные указали, что средства, влияющие на микроглию, имеют терапевтическое значение для лечения депрессии.

Воспалительные цитокины играют важную роль в депрессии.

  • Предыдущие исследования показали, что дисбаланс между про- и противовоспалительными цитокинами может быть одним из основных механизмов патогенеза депрессии.
  • В настоящем исследовании более высокая экспрессия ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α и более низкая экспрессия ИЛ-4, ИЛ-10 и TGF-β наблюдались в гиппокампе у CMS-индуцированных мышей.
  • Было предложено много доказательств того, что агонист PPARy пиоглитазон может регулировать воспалительный ответ и окислительный стресс.
  • После лечения пиоглитазоном у CMS-мышей экспрессия провоспалительных молекул снижена и уровень противовоспалительных цитокинов увеличен.
  • Эти результаты согласуются с недавними выводами о том, что агонист PPARy может способствовать переходу из фенотипа М1 в М2, а также увеличить производство противовоспалительных цитокинов, такие как ИЛ-10 и TGF-ß.

Источник:

  1. Zhao Q, Wu X, Yan S, et al. The antidepressant-like effects of pioglitazone in a chronic mild stress mouse model are associated with PPARγ-mediated alteration of microglial activation phenotypes. Journal of Neuroinflammation. 2016;13:259. doi:10.1186/s12974-016-0728-y.
%d такие блоггеры, как: