Протеинкиназа А и АКТГ-независимый гиперкортицизм

Эндогенное повышение уровня кортизола ассоциировано с высокой заболеваемостью и смертностью.

• Гиперсекреция кортизола может быть:
  • связана с избыточной секрецией АКТГ гипофизом или эктопической секрецией АКТГ,
  • АКТГ-независимым гиперкортицизмом в результате избыточной секрецией кортизола новообразованием надпочечника.
• Молекулярный патогенез кортизол-продуцирующих аденом надпочечников не до конца изучен.
• Поскольку соматическая мутация в гене, кодирующий бета-катенин (CTNNB1) была найдена первично в гормонально-неактивных аденомах коры надпочечников,  сделано предположение, что гормональная активность может быть связана  с нарушенным сигналом циклической АМФ (цAMФ).
• Например, эктопическая экспрессия G-белковых рецепторов нейроэндокринных гормонов или нейротрансмиттеров, которые реализуют своих эффекты посредством цАМФ, влечет за собой :
  • алиментарно-зависимое повышение уровня кортизола,
  • кортизол-продуцирующие аденомы,
  • билатеральная гиперплазия коры надпочечников.
• Более того, соматическая мутация в гене CTNNB1 кодирует:
  • альфа субъединицу, стимулирующую G белок (GNAS1),
    • которая в свою очередь ведет к развитию аденомы или гиперплазии коры надпочечников, ведущую к синдрому Кушинга у пациентов с синдромом Мак-Кьюна Олбрайта или макронодулярной гиперплазии.
• Так же у пациентов с синдромом Кушинга, вызванного первичной пигментированной гиперплазией коры надпочечников и, в некоторых случаях, кортизол-продуцирующими аденомами надпочечников выявлены мутации в генах:
  • цАМФ – деградирующей фосфодиэстеразы 11A (PDE11A),
  • фосфодиэстеразы 8B (PDE8B),
  • регуляторной субъединицы цАМФ зависимой протеинкиназы (PRKAR1A).
• Эти генетические нарушения, в любом случае, объясняют только небольшую часть причин.

Лишь часть аденом надпочечников характеризуются повышенной активностью протеинкиназы, независимо от отсутствия мутаций в генах, что свидетельствует о наличии до сих пор не изученных в этих опухолях изменений в цАМФ–ПКА сигнальных каскадах.

Методы

Пациенты были выбраны из 3 центров, которые участвуют в Европейской сети исследований адренальных опухолей (Study of Adrenal Tumors), и в Американском институте здоровья (U.S. National Institutes of Health).

• В исследование было включено 139 пациентов с аденомой надпочечников
  • 42 пациента с адренокортикальной карциномой
  • 35 пациентов с АКТГ-независимой билатеральной надпочечниковой гиперплазией, без мутаций в генах PRKAR1A, PDE11A или PDE8B или соматической мутацией GNAS
    • 33 пациента с микронодулярной гиперплазией коры надпочечников,
    • 2 с макронодулярной гиперплазией.
• Во всех случаях диагноз был подтвержден гистологически после хирургического вмешательства.
• Все пациенты дали письменное согласие и исследование было одобрено этическим комитетом в каждом отдельном случае.

Диагноз  АКТГ-независимого  синдрома Кушинга  был основан на биохимических маркерах гиперкортицизма:

• повышенная экскреция кортизола с мочой,
• увеличенное содержание свободного кортизрла в крови и в слюне в 23.00,
• отрицательная малая дексаметазоновая проба.

Пациенты определялись, как имеющие манифестный синдром Кушинга, если у них выявлялись:

• 3 вышеперечисленных биохимических маркера гиперкортицизма,
• 2 биохимических маркера гиперкортицизма при наличии катаболических признаков (мышечная слабость, остеопороз, хрупкость кожи).

При отсутствии биохимических маркеров и отсутствии катаболических признаков гиперкортицизма диагностировалась гормонально-неактивная аденома коры надпочечника.

Все пациенты, у которых не было обнаружено ни одного катаболического признака, но был хотя бы один измененный результат вышеупомянутых тестов, были классифицированы, как имеющие субклинический синдром Кушинга.

• ДНК выделена из односторонних опухолей надпочечников у 181 пациента, и, для сравнения, из нормальной ткани надпочечника у 26 пациентов из всех исследуемых.
• Гаметическая ДНК была выделена у 35 пациентов с двусторонней гиперплазией, ДНК из образцов надпочечниковой ткани, полученных хирургическим путем, была доступна у 10 из 35 пациентов.

Секвенирование экзомов

• Экзомы были обогащены в растворе и упорядочены с использованием SureSelect XT Human All Exon 50Mb kit, version 4 (Agilent Technologies).
• Последовательности были исследованы на  HiSeq2000 системах (Illumina).
• Образцы 12 выбранных пулов были секвенированы в 4 треках.
• Анализ изображения и распознавание азотистых оснований было произведено с помощью Real-Time Analysis software (Illumina).

Сравнительная геномная гибридизация

• Сравнительный  геномный  гибридизационный анализ  был произведен с использованием коммерческой тест-системы, согласно инструкции производителя.
• Структурные изображения были сделаны с использованием PyMOL обеспечения.
  Структура полноразмерного тетрамерного RIIβ(2):Cα(2) голоэнзима мыши была использована для отображения структур ПКА каталитической субъединицы (Cα) и регуляторной субъединицы (RIIβ).

ДНК-конструкции и  сайт-направленный мутагенез

• Плазмиды, кодирующие немутантные человеческие RIIβ или Cα субъединицы были приобретены в OriGene Technologies. Плазмида, содержащая PRKACA была использована для  сайт-специфического мутагенеза  с c.617A→C  и c.595_596insCAC мутация была введена с использованием QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, согласно инструкции производителя.
• Мутация была подтверждена результатом секвенирования.

Подтверждение ПКА активности в интактных клетках

• Клетки эмбриональной почки человека в количестве 293 единиц были трансфектированны с AKAR4-NES(белковый передатчик 4 с лидерной последовательностью) сенсором, таким образом, активность ПКА была отслежена с помощью изображений  метода резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Трансфекция и FRET изображения были выполнены, как описывалось ранее. Эквимолярные концентрации клеточно — проницаемых пар синергичных цАМФ аналогичны тем, что были использованы при активации ПКА II.

Определение белка PRKACA и ПКА активности

• Цельные клетки или лизаты тканей были изучены в качестве экспрессии ПКА Cα субъединицы посредством Western blotting с использованием антител (sc-903, Santa Cruz Biotechnology). COS-7 клетки были трансфектированы с использованием X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche) и 500 ng плазмидной ДН.
  Для трансфекции, включающей обе ПКА Cα(немутантная  или Leu206Arg вариант) и RIIβ субъединиц, была использована молярная концентрация 1:8.
  В лизированных клетках от эксперимента трансфекции  или в клетках, полученных от пациентов, активность ПКА была определена с помощью ферментного анализа.

Ген-экспрессирующий микроматричный анализ  и ПЦР в режиме реального времени

• Ранний микроматричный  анализ 22 аденом был расширен включением 39 аденом в текущем  исследовании (отражено Table S1 in the Supplementary Appendix).
  Для подтверждения  экспрессии PRKACA, была использована ПЦР в режиме реального времени.

Статистический анализ

• Данные были сопоставлены с двумя группами с использованием теста Mann–Whitney U и среди 3 групп с использованием теста Kruskal–Wallis.
• Все сопоставления были двусторонними и Р уровень как минимум 0.05 был сочтен как показатель статистической важности.
• Анализ был произведен с использованием программы SPSS (версия 20).

Результаты

Соматические мутации  и наследственная дупликация  в кортизол-продуцирующих очагах

• Секвенирование генома было произведено в пробах 10 пациентов с односторонней кортизол-продуцирующей аденомой и манифестным синдромом Кушинга.
  • Обнаружен низкий уровень соматических мутаций в аденоме.
  • Внутри этой малой выборки генетических поражений, соматическая вариация PRKACA, кодирующая субъединицу Cα ПКА, была найдена в 8 из 10 опухолей (c.617A→C, p.Leu206Arg in 7 andc.595_596insCAC, Leu199_Cys200insTrp in 1).
  • Пораженные аминокислоты были высококонсервативны у различных видов.
• На основании этих начальных результатов PRKACA была секвенирована в 129 аденомах (включая 89 кортизол-продуцирующих, 20 альдостерон-продуцирующих, и 20 гормонально неактивных аденом)
  • В 33 из этих образцов были обнаружены полные кодирующие последовательности
  • В оставшихся 96 образцах было произведено секвенирование в участках скопления мутаций.
    • Вариант Leu206Arg был обнаружен в 14 случаях из 129 аденом, и во всех случаях с этим генетическим вариантом был поставлен манифестный синдром Кушинга, согласно установленным критериям.
  • Полноэкзомное и прицельное секвенирование выявили, что мутантной и немутантной аллели присутствуют в опухолевой ткани соответствующий гетерозиготному состоянию PRKACA.
  • У пациенов, имеющих синдром, не было обнаружено мутации PRKACA в лейкоцитах (19 пациентов) или жировой ткани (1 пациент) или близлежащей нормальной адренальной ткани (6 пациентов).
• Сравнительная геномная гибридизация образцов 35 пациентов с кортизол-секретирующей билатеральной гиперплазией и манифестным синдромом Кушинга выявила 5 пациентов (4 родственника) с дуплицированным участком 19p хромосомы, которая включает PRKACA.
  • В одном случае, дефект был наследуемым: мать и сын, оба несущие одинаковую PRKACA дупликацию, страдали билатеральной крупноузелковой гиперплазией.
  • В другом случае, у 3 летнего мальчика, с синдромом Кушинга, вызванного мелкоузелковой гиперплазией, дефект возник первично, поскольку ни один родитель не нес PRKACA мутации.
• Никакой амплификации PRKACA не было найдено в 24 кортизол-продуцирующих адренальных аденомах, анализированных способом однонуклеотидного полиморфизма (SNP)
• Ни одной PRKACA не было обнаружено в 1600 «собственных» экзомах или в 1000 Genomes Project data set (version 0.0.14).
• Несмотря на то, что удвоение PRKACA было описано в публичных базах данных, варианты количества копий в, как минимум, 6 случаях (образующихся у пациентов направленных на генетическое тестирование по причине отставания в развитии), никаких полных дупликаций PRKACA не было включено в базу данных геномных вариантов (Database of Genomic Variants), которая основывается на генеральной совокупности.

PRKACA мутация и регуляция каталической субъединицей регуляторной субъединицы

• Анализ структуры полноразмерного тетрамерного голоэнзима мыши RIIβ(2):Cα(2) выявил, что мутация находится в высококонсервативной основе взимодействия между регляторной и каталитической субъединицей ПКА, — данные, которые подтверждают функциональную значимость Leu206Arg варианта.
• Leu206, — это часть активного центра, отщепленная от каталитической субъединицы, ингибиторная последовательность которой крепится к регуляторной субъединице, имитируя субстрат каталитической субъединицы.
• Это взаимодействие поддерживает каталитическую субъединицу в инактивированном виде в отсутствие цАМФ.
• Обмен Leu206 с объемистой  и позитивно заряженной  аминокислотой  Arg между боковыми цепями мутировавшего Arg206 в Cα субъединице  Val115 и Tyr228 в RIIβ субъединице.
• Функциональные проявления двух выявленных вариантов (Leu206Arg и Leu199_Cys200insTrp), были обнаружены в интактных клетках посредством FRET микроскопии  с использованием сенсора протеинкиназной активности (AKAR4-NES).
• Протеинкиназная активность в клетках, трансфектированных  только вместе с таким же немутантным Cα или его вариантами,  была высока и  также не была стимулирована аналогами цАМФ, что указывает сохранение каталитической активности  в мутантных клетках.
• Тем не менее, после ретрансфекции с избыточной немутнатной RIIβ, базальная активность ПКА в клетках была уменьшена в клетках, транфектированных  немутантной       Cα и ставших восприимчивыми к аналогам цАМФ.
• А протеинкиназная активность  в клетке, трансфицированной  мутантными генами, оставалась высокой и невосприимчивой к аналогам цАМФ.
• Эти данные указывают, что мутации делают каталитическую субъединицу резистентной к физиологическому подавлению регуляторной суъединицей.
• Недостаток супрессии сохраняется, когда равное количество немутантной Cα было котрансфектировано, что указывает на доминантный эффект этих мутаций.
• Сходным образом трансфекция мутантной Leu206Arg вызывает значительное увеличение протеинкиназной активности над базальными характеристиками, таким образом
  • протеинкиназная активность была на том же уровне как и в тех клетках, которые были транфектированы немутантной Cα и стимулированы цАМФ, в отсутствии подавления котрансфекцией с RIIβ, что указывает также на дефицит супрессии  мутантной каталитической субъединицы регуляторной субъединицей .
• Согласно этим результатам , базальная активность ПКА в опухолевой ткани была обнаружена повышенной в образцах аденомы с мутацией PRKACA чем в них же без мутации.
• Эти данные свидетельствуют, что мутантный белок Leu206Arg конститутивно активируется и не подавляется регуляторной субъединицей.

Ассоциация герминативной дупликации PRKACA с увеличенным уровнем белка и протеинкиназной активностью

• Как сравненные с образцами опухолевой ткани от пациентов, без каких либо генетических дефектов, образцы опухолевой ткани с дупликацией PRKACA имеют повышенный ПКА Cα, мессенджер РНК и уровень белка.
• Иммунногистохимические анализы подтвердили  повышенную экспрессию субъединицы ПКА Cα в адренальной ткани от этих пациентов.
• Повышенная экспрессия субъединицы ПКА Cα ассоциирована с повышенной базальной  и стимулированной цАМФ активностью. Клинический фенотип и статус мутации PRKACA.
• 22 из 59 пациентов с манифестным синдромом Кушинга с односторонней аденомой содержали мутацию PRKACA, однако это нарушение не присутствовало в любых аденомах ассоциированных с :
  • субклиническим синдромом Кушинга (40 пациентов)
  • в инактивированных адренальных аденомах (20)
  • альдостерон-продуцирующих адренальных аденомах (20 пациентов )
  • адренокортикальных карциномах (42 пациента)
  • в адренальной ткани (10 пациентов) или лимфатической ДНК (35 пациентов) от пациентов с АКТГ-независимой адренальной гиперплазией (35 пациентов).
• Кроме того, в группе пациентов с манифестным синдромом Кушинга, присутствие PRKACA мутации  было ассоциировано с более тяжелым фенотипом заболевания.
• Соответственно уровни экспрессии вариативных стероидогенных ферментов в мутантных опухолях железистой ткани были выше в присутствии PRKACA мутации.
• Нет очевидной фенотипической разницы между пациентами с наследственной PRKACA дупликацией и  без дупликации, хоть и число пациентов с дупликацией было мало.
• У матери и сына синдром Кушинга имел легкое течение, с постепенным нарастанием симптомов, вызванный билатеральной макронодулярной гиперплазией, манифеструющий в третьей или четвертой декаде жизни.
• Три маленьких мальчика с синдромом Кушинга, возникающем при билатеральной гиперплазии (2 с микронодулярной и 1 с макронодулярной), имели тяжелые проявления болезни схожие с пациентами, имеющие соматическую мутацию.
• Один пациент с дупликацией PRKACA имел парадоксальное увеличение секреции кортизола после назначения дексаметазона, хотя остальные 4 пациента не подвергались малой дексаметазоновой пробе перед хирургическим вмешательством.

Обсуждение

• Несмотря на данные, что усиленный цАМФ сигнал является виновником многих доброкачественных поражений надпочечников, ведущих к развитию синдрома Кушинга, исследование мутаций, несущих неопластическое действие  в  аденомах надпочечников, с использованием метода «кандидатных генов» выявляет очень редкие мутации в отдельных группах пациентов.
• Настоящая работа свидетельствует, что больше чем одна треть кортизол-продуцирующих аденом ассоциирована с манифестным синдромом Кушинга, имеющего уникальную соматическую мутацию в PRKACA (которая кодирует основную каталитическую субъединицу ПКА), приводящую к конститутивной активации ПКА.
• Такая же мутация, как присутствующая только в опухолевых клетках этих пациентов, наследственная дупликация PRKACA, была идентифицирована в группе пациентов  с билатеральной адренальной гиперплазией.
• Пациенты с соматическим дефектом имеют односторонние аденомы, в то время как у  пациентов с наследственной дупликацией проявлялась билатеральная  надпочечниковая гиперплазия.
• Все пациенты с дефектом PRKACA, все равно, соматическим или наследственным, имели манифестный синдром Кушинга.
• Ни один пациент с субклиническим синдромом Кушинга  или другими опухолями надпочечников не имели генетическим повреждением мутацию.
  • Таким образом, исследования стали подтверждением, что активация PRKACA  ведет к более значительному избытку кортизола, чем ожидаемый при конститутивной активации ферментов, которые запускают АКТГ-зависимые эффекты в надпочечниковом стероидогенезе.
• Так же данные результатов исследования указывают, что субклинический синдром Кушинга не  является самой ранней формой манифестирующей болезни, а скорее является отдельным патогенетическим фактором болезни.
• Поскольку PRKACA опосредует  большинство эффектов инактивирующих  мутацию PRKAR1A и поскольку PRKAR1A ассоциирована с изменчивостью опухолей у человека и мышей, можно сделать вывод, что соматический PRKACA дефект также может играть роль в других эндокринных и неэндокринных опухолях.

Протеинкиназа, как цАМФ зависимая  серин-треонин киназа, представляет собой наиболее изученную киназу и пример аллостерической регуляции.

• В его инактивированном состоянии это тетрамерный голоэнзим, состоящий из регуляторного димера и двух каталитических суъбединиц, при физиологических условиях протеинкиназная активность опосредуется через G белковые связанные рецепторы через увеличение уровней цАМФ.
• Связанная с цАМФ, регуляторная субъединица разобщает каталитические субъединицы , позволяя ферменту стать активным.
• Так же, произвольно привнесенные мутации в PRKACA, представленные в результате беспрепятственной активации in vitro, некоторые повреждения при которых  не были  связаны с человеческими болезнями.
• Обнаружена одна естественная мутация, с приобретением функции PRKACA, которая  была описана в Cos1(A1) мутантном гене дрозофил.
• Две мутантных PRKACA, обнаруженных в текущем исследовании, меняют структуру каталитической субъединицы как сайта взаимодействия с регуляторной единицей, таким образом,  обуславливая сохранение высокой активности каталитической субъединицы в отсутствие цАМФ.
• Главную функцию Leu206Arg мутации в центре взаимодействия между каталитической субъединицей  и ингибирующим сайтом, объединяющим стерическое препятствие, включающее Val115  и Tyr228в регуляторные субъединицы, может объяснить высокий уровень специфичности  в этой конкретной мутации.
• В заключение можно сказать,  что текущее исследование связывает  генетические варианты основных каталитических суъединиц ПКА с гиперплазиями и аденомами  коры надпочечников,  ведущих к кортикотропин  — независимому синдрому Кушинга.
• Эти исследования согласуются с пониманием роли пути сигнала цАМФ в адренальных поражениях, которые ассоциируют с синдромом Кушинга.

Источник:

1. Constitutive activation of PKA catalytic subunit in adrenal Cushing’s syndrome. Beuschlein F1, Fassnacht M, Assié G, Calebiro D, Stratakis CA, Osswald A, Ronchi CL, Wieland T, Sbiera S, Faucz FR, Schaak K, Schmittfull A, Schwarzmayr T, Barreau O, Vezzosi D, Rizk-Rabin M, Zabel U, Szarek E, Salpea P, Forlino A, Vetro A, Zuffardi O, Kisker C, Diener S, Meitinger T, Lohse MJ, Reincke M, Bertherat J, Strom TM, Allolio B. N Engl J Med 2014; 370:1019-1028 March 13, 2014 DOI: 10.1056/NEJMoa1310359