Экспрессия генов рецепторов, активируемых PPARs-γ, и ее связь с оксидативным стрессом у пациентов с метаболическим синдромом

• Регуляция гена рецептора γ-типа, активируемого пероксисомным пролифератором (PPAR-γ), играет важную роль в контроле метаболизма липидов и в воспалительных процессах. Таким образом, она может быть связана с патогенезом метаболического синдрома (МС).
• Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить экспрессию этого гена в одноядерных клетках периферической крови (РВМС) у больных с МС.
  • Используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени, экспрессия матричной РНК (мРНК) данного рецептора PPAR-γ была обнаружена в мононуклеарных клетках периферической крови у 37 пациентов с МС и у 30 здоровых людей.
  • Были определены уровень глюкозы в сыворотке крови и липидный профиль.
  • Общую антиоксидантную активность определяли с помощью теста на способность плазмы восстанавливать трехвалентное железо.
  • Малоновый диальдегид (МДА) определяли с использованием флуоресцентного метода.
  • Суммарный оксидативный статус в сыворотке крови оценивали в соответсвии с окислением трехвалентного железа до двухвалентного в присутствии метилового оранжевого.
  • Активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли с использованием набора Randox.
• Экспрессия гена PPAR-γ была значительно повышена у пациентов с МС по сравнению с контрольной группой (р = 0,002).
• Не было выявлено различий в сывороточных уровнях общей антиоксидантной активности, MДA и СОД между двумя группами, но существенная разница наблюдалась при определении суммарного оксидативного статуса (р = 0,03).
• Сывороточные уровни триглицеридов и глюкозы были значительно выше у пациентов с MС.
• По результатам этого исследования установлено, что увеличение экспрессии PPAR-γ у пациентов с МС указывает на возможную роль PPAR-γ в патогенезе этого заболевания.

ВВЕДЕНИЕ

• Метаболический синдром (MС) включает комплекс различных заболеваний, характеризующихся
  • нарушением толерантности к глюкозе или гипергликемией,
  • абдоминальным ожирением,
  • повышением АД,
  • дислипидемией.
• Ожирение и МС связаны с повышенным риском развития
  • сердечно-сосудистых заболеваний,
  • сахарного диабета 2 типа,
  • артериальной гипертензии,
  • гиперлипидемии,
  • а также с повышением риска смертности и заболеваемости некоторыми видами рака.

Для этих состояний характерно изменение оксидантного/антиоксидантного статуса и стертая картина воспаления, ответственных за развитие атеросклероза.

• В последнее время наблюдается целенаправленный интерес к роли оксидативного стресса в начале развития МС и инсулинорезистентности.
• Увеличение синтеза активных форм кислорода (АФК) и / или выхода из строя механизмов защиты от АФК могут стать причиной МС и привести к увеличению оксидативного стресса.
• В нормальных физиологических условиях, различные антиоксидантные системы устраняют или инактивируют АКФ и свободные радикалы.
• Супероксиддисмутаза (СОД) преобразует супероксиданионы (O2-) в перекись водорода, а затем перекись водорода восстанавливается с помощью фермента глутатионпероксидазы (GSH-Px).
• С другой стороны, каталаза, единственный фермент пероксисом, также обезвреживает перекись водорода.
• Кроме того, существуют различные молекулы, которые устраняют или инактивируют АФК.
  • Это эндогенные молекулы такие, как мочевая кислота и альбумин, и экзогенные антиоксиданты, получаемые с пищей, такие, как аскорбиновая кислота и витамин Е.
  • Сумма эндогенных и экзогенных антиоксидантов представляет собой общую антиоксидантную активность внеклеточной жидкости.
• Представители суперсемейства ядерных рецепторов к гормонам, рецепторов PPARs являются лиганд-зависимыми факторами транскрипции, которые экспрессируются преимущественно в жировой ткани, и, как известно, участвуют в дифференцировке адипоцитов и являются регуляторами адипогенеза.
• Намного меньше PPAR- γ найдено в других тканях, таких как скелетные мышцы и печень, основных тканей-мишеней для инсулина.
• Экспрессия PPAR-γ было выявлена в одноядерных клетках периферической крови человека, таких как макрофаги и моноциты, где она играет важную роль в регуляции воспалительных процессов.
• Противовоспалительное действие PPAR-γ обусловлено ингибированием продукции воспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α в моноцитах и ядерный фактор каппа В (NF-кВ).
• Гиперметаболизм ассоциирован с изменениями в окислительных процессах, а именно,
  • с повышенным образованием свободных радикалов,
  • оксидативным стрессом,
  • и, наконец, с острой фазой воспаления.
• В жировой ткани, по последним данным, ответ острой фазы связан с низкоуровневой регуляцией PPAR-γ.
  • Это логично, так как PPAR-γ, как правило, являются противовоспалительными и обладают повышенной чувствительностью к инсулину.
• Поскольку установлена роль PPAR-γ в воспалительных процессах и в метаболизме липидов, то они могут быть ассоциированы с патогенезом МС.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить экспрессию гена PPAR-γ в одноядерных клетках периферической крови у пациентов с МС и сравнить ее с экспрессией гена этого рецептора у здоровой контрольной группы.

Определение возможной связи экспрессии гена PPAR-γ с антиоксидантными величинами в опытной и контрольной группах стало еще одной целью данного исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Пациенты

В исследовании приняли участие 30 здоровых испытуемых без МС и 37 пациентов с МС. МС был диагностирован, при наличии у больных как минимум трех положительных критериев из следующих:

1. систолическое артериальное давление (САД) ≥130 мм рт.ст. и диастолическое артериальное давление (ДАД) ≥85 мм рт.ст.,
2. уровень глюкозы в крови натощак ≥ 6.05 ммоль/л или 100 мг/дл,
3. окружность талии ≥90 см у женщин,
4. липопротеины низкой плотности (ЛПНП) ≤50 мг/дл (для женщин),
5. триглицериды (ТГ) ≥ 150 мг/дл.

Критериями исключения стали пациенты с СД, артериальной гипертензией, заболеваниями печени, почек или щитовидной железы. Кроме того, из исследования исключались пациенты, получавшие антигиперлипидемические препараты, а также беременные.

• У всех участников проводили забор крови ночью натощак и образцы собирали в три пробирки для сыворотки и плазмы, используя этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), а также для выделения одноядерных клеток периферической крови. Плазму и сыворотку отделяли центрифугированием (1000 г, 5 мин).
• Рост, вес, индекс массы тела, окружность талии, уровень систолического и диастолического артериального давления также были измерены у всех участников.
• Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике Хамаданского университета медицинских наук (г. Хамадан, Иран) в соответствии с Хельсинской декларацией.
• Письменное информированное добровольное согласие было получено от всех участников исследования.

2. Определение биохимических показателей

• Образцы сыворотки были использованы для определения уровня глюкозы в крови натощак, общего холестерина, ТГ, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) или липопротеины низкой плотности (ЛПНП).
  • Ферментные калориметрические наборы использовали для измерения уровней общего холестерина, триглицеридов и глюкозы в крови (Pars Azmun, Иран).
  • Гомогенный ферментный калориметрический тест использовали для измерения уровней в сыворотке крови ЛПНП и ЛПВП.

3. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови, извлечение РНК и синтез комплементарной ДНК (кДНК)

• Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из обработанных антикоагулянтом образцов крови с помощью центрифугирования градиента плотности по стандарту Ficoll (1000 г; 5 мин).
• Суммарную РНК из образцов мононуклеарных клеток периферической крови выделяли с использованием метода разделения колонок.
• Выделенную РНК обрабатывали ДНК-азой I (Fermentas Inc., Вильнюс, Литва) для удаления любого возможного дефекта ДНК;
  • это делали с помощью спектрофотометра NanoDrop (Эппендорф, Гамбург, Германия) с шагом 260 нм.
• Целостность РНК была проверена путем определения коэффициента абсорбции оптической плотности OD260 нм / OD280 нм, его значение было между 1,8 и 2,0.
• кДНК получили из 1 мкг суммарного образца РНК.
  • Полученная кДНК использовалась в качестве шаблона для проведения ПЦР в режиме реального времени (количественная ПЦР).

4. Анализ результатов количественной ПЦР

• Количественная ПЦР, проводимая с помощью qPCRTM Green Master Kit for SYBR Green IW (Jena Biosciense, GmbH, Германия) была разработана с целью определения относительных уровней мРНК рецепторов PPAR-γ в мононуклеарных клетках периферической крови.
• Относительные уровни экспрессии транскрипции PPAR-γ были упорядочены для РНК-нагрузки для каждого образца с использованием  18S рРНК. Специфические праймеры для всех генов были разработаны с использованием программного обеспечения AlleleID (версия 7.6).
• Последовательности аминокислотных остатков смыслового и антисмыслового праймеров для PPAR- γ и контрольного гена (18S рРНК) приведены в таблице 1.
• ПЦР проводили на растворе с конечным объемом 20 мл, содержащем 1 мл кДНК, 7 мл деионизованной воды, по 1 мл смыслового и антисмыслового праймеров и 10 мл SYBR Green IW. Реакции проводили (в трех экземплярах) с соблюдением следующих условий:
  • 10 минут предварительной инкубации при 95 °C с последующими 40 циклами в течение 30 секунд при 95°C и 30 секунд при 72°C.
• Реакцию без кДНК проводили параллельно в качестве отрицательного контроля.
• Используя стандартную кривую, было получено относительное число копий и упорядочено для значений, которые были получены в отношении контрольного гена 18s рРНК.
• Чтобы показать относительную экспрессию PPAR-γ, изменение экспрессии на кривой рассчитали по формуле 2^-ΔΔct.

5. Антиоксидантный анализ

• Концентрацию в сыворотке крови МДА определяли с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой.
• Общую антиоксидантную активность определяли с помощью теста на способность плазмы восстанавливать трехвалентное железо, и спектральный состав был обнаружен на длине волны 520 нм, используя спектрофотометр, как описано Benzie и Strain.
• Активность СОД определяли при участии ксантиноксидазы с использованием набора Randox (Randox Labs, Крамлин, Великобритания).
• Оптическая плотность была считана при длине волны 550 нм с использованием спектрофотометра.
• Суммарный оксидативный статус оценивали с помощью нового метода колориметрического анализа, разработанного Эрель.

6. Статистический анализ

• Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения SPSS 18.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США).
• Т-тест независимых выборок был использован для определения различий в параметрах между двумя исследуемыми группами.
• Все экспериментальные данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.
• Коэффициент корреляции Спирмена был рассчитан для оценки связи между переменными.
• Значения считались статистически значимыми при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

• Сравнение уровней САД и ДАД, окружности талии, индекса массы тела (ИМТ) и биохимических параметров между исследуемыми группами представлены в таблице 2.
• Были выявлены существенные различия в значениях веса (р = 0,001), ИМТ (р = 0,001), окружности талии (р = 0,001) и в уровне САД (р = 0,002) при отсутствии существенного различия в уровне ДАД.
• Сравнение биохимических параметров показало более высокие значения глюкозы в крови натощак (р = 0,001) и ТГ (р = 0,029) у испытуемых с MС, однако не оказалось существенных различий в показателях общего холестерина, ЛПНП и ЛПВП между исследуемыми группами.
• Хотя ни у одного из участников контрольной группы не было совокупности критериев, позволяющих поставить им диагноз МС, некоторые признаки МС по отдельности в некоторых случаях все-таки наблюдались:
  • окружность талии  ≥90 см у женщин контрольной группы – в 17%,
  • ЛПНП ≤50 мг/дл (для женщин) в 13%,
  • ТГ ≥ 150 мг/дл в 10%,
  • уровень глюкозы в крови натощак ≥ 6.05 ммоль/л в 10%.
• Значения параметров оксидативного стресса приведены в таблице 3.
• Никаких существенных различий в уровнях общей антиоксидантной активности, МДА и СОД не было найдено между двумя группами.
  • Единственным параметром, который был значительно выше в группе MС, оказался суммарный оксидативный статус (р = 0,03).
• Рисунок 1 иллюстрирует ΔCt гена PPAR-γ, который значительно ниже в основной группе по сравнению с контрольной (р = 0,002), что указывает на более высокую экспрессию этого гена у больных с МС.
  • Для дальнейшего анализа относительной экспрессии гена PPAR-γ кратность изменения этого гена в группе с MС рассчитывалась по формуле 2-ΔΔCt.
  • Полученные результаты показали, что экспрессия гена PPAR-γ в  9,5 раза выше в группе с MС.
• Также была определена корреляция экспрессии гена PPAR- γ с параметрами MС.
  • Экспрессия гена PPAR-γ в группе MС показала отрицательную корреляцию с ЛПВП (r=-0,35, р=0,03) и положительную корреляцию с ТГ (r=0,42, р=0,026).
  • Не наблюдалось статистически значимой корреляции между экспрессией гена PPAR-γ и другими параметрами MС в обеих группах.
• Кроме того, не было никакой связи между экспрессией гена PPAR-γ и антиоксидантными параметрами в основной и контрольной группе.

В данном исследовании оценивали экспрессию гена PPAR- γ в группе пациентов с МС, также изучали связь между МС, сывороточными изменениями липидов и оксидативным статусом.

МС является многофакторным расстройством, и его причины точно не определены.

• Выше экспрессия PPAR-γ наблюдалась у лиц с MС по сравнению с контрольной группой здоровых людей.
• PPAR-γ представляет собой лиганд-активированный фактор транскрипции, принадлежащий к суперсемейству ядерных рецепторов, и играет важную роль в метаболизме липидов и глюкозы.
• Эти рецепторы повышают поглощение липидов макрофагами, а также экспорт липидов.
• Было определено, что PPAR-γ находятся адипоцитах и человеческих мононуклеарных клетках периферической крови.
• Более высокая экспрессия этого гена наблюдась после потребления пищи с высоким содержанием жиров здоровыми людьми.
• Противовоспалительные свойства PPAR- γ широко рассмотрены в других исследованиях.
  • При ожирении производство воспалительных цитокинов таких, как ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6, является исходом  метаболических изменений в широком диапазоне.
  • Было показано, что ФНО-α и ИЛ-1β напрямую уменьшают уровень PPAR-γ.
  • Были выявлены более высокие уровни экспрессии PPAR-γ в мононуклеарных клетках периферической крови у пациентов с МС, что связано со значительным более высоким уровнем ТГ в плазме крови.
  • Garcia-Fuentes с соавт. изучали экспрессию PPAR-γ в мононуклеарных клетках периферической крови у лиц с ожирением. Они обнаружили, что снижение экспрессии PPAR- γ коррелирует с увеличением концентрации свободных жирных кислот.
  • Изменения в окислительном метаболизме сопровождаются увеличением образования свободных радикалов и параметров оксидативного стресса.
  • Существует доказательство того, что лиганды PPAR-γ могут повышать экспрессию и активность Cu/Zn СОД и снижать экспрессию НАДФН-оксидазы в сосудисто-эндотелиальных клетках, in vitro.
• Связь между этим геном и антиоксидантными параметрами изучали в данном исследовании.
• Не выявлено корреляции между уровнями PPAR-γ и антиоксидантными параметрами. Такие результаты не подтверждают гипотезу о том, что PPAR-γ влияют на эти параметры.
  • Более высокая экспрессия гена PPAR-γ, которая наблюдалась в группе с MС похожа на то, к чему пришли в исследовании Macias-Gonzalez с соавт.
    • В их исследовании, экспрессия  гена PPAR-γ  была выше у больных субъектов по сравнению со здоровыми.
    • Тем не менее, было отмечено снижение уровня PPAR-γ у больных MС после нагрузки жирной пищей по сравнению с исходным уровнем.
    • В противоположность этому у здоровых лиц наблюдалось увеличение уровня экспрессии PPAR-γ после употребления пищи, богатой жирами.
    • Снижение экспрессии гена PPAR-γ может объяснить основную концепцию »насыщения», возникающую из-за ограничений в распространении жира и липидного обмена в периферических тканях, в патофизиологических ситуациях. Это «насыщение» в липидном балансе может привести к липотоксичности, которая заканчивается «насыщением» антиоксидантного механизма и может, в итоге, повлиять на регулирование экспрессии гена PPAR- γ.
• Garcia-Fuentes с соавт. обнаружили, что в группе лиц с ожирением, активность  СОД в плазме и экспрессия мРНК PPAR-γ снизились после приема пищи с высоким содержанием жиров. Кроме того, они показали, что экспрессия PPAR-γ после приема богатой жиром пищи коррелирует с плазменной активностью СОД.

Можно предположить, что активации PPAR-γ в данном исследовании могут способствовать дифференцировке адипоцитов, что приводит к уменьшению воспалительного состояния жировой ткани во время ожирения.

• Питание, приводящее к ожирению, имеет взаимосвязь с повышенной экспрессией генов, ответственных за воспаление,  в жировой ткани посредством гипертрофии адипоцитов и макрофагальной инфильтрации.
• Было установлено, что PPAR-γ способны изменять инфильтрацию макрофагов и в дальнейшем снижать экспрессию воспалительных генов.
• Кроме того, можно предположить, что реактивация PPAR-γ является ответом организма для того, чтобы восстановить метаболический баланс при МС.

В данном исследовании увеличение антиоксидантных параметров было незначительно. Тем не менее, суммарный оксидативный статус был значительно повышен, что может указывать на увеличение липотоксичности.

• Не наблюдалась статистически значимая связь между экспрессией PPAR-γ гена и состоянием оксидативного стресса у больных MС. Это могло быть из-за ограниченного числа лиц, участвовавших в данном исследовании.

Ученые считают, что необходимы интенсивные исследования механизмов патогенеза МС. Изменение экспрессии некоторых генов при МС могут привести к ожирению, СД и АГ.

• Авторы данного исследования установили, что экспрессия гена ABCG1, одного из трансмембранных транспортеров ABC, существенно снижается при МС.
• Пониженная регуляция ABCG1 может влиять на выброс холестерина в кровь и предрасполагать к развитию атеросклероза.

Также выявлены изменения в экспрессии генов некоторых цитокинов при МС.

• Увеличение экспрессии гена рецептора лептина и уменьшение экспрессии ИЛ-10 и ИЛ-8 было зарегистрировано при МС.
• Оданако никаких существенных изменений не наблюдалось в экспрессии ИЛ-7.
• Считается, что МС вызван хронической активацией врожденного иммунитета, что может быть связано с некоторыми параметрами МС.
• Изменения в вышеупомянутых цитокинах, рецепторов лептина и PPAR- γ могут играть определенную роль в развитии МС.

Увеличение экспрессии PPAR-γ гена у пациентов с МС в результатах указывает на возможную его роль в патогенезе этого заболевания. Повышение концентрации PPAR-γ возможно является физиологической реакцией организма  для повышения устойчивости к оксидативному стрессу.

Источник:

1. Hatami M, Saidijam M, Yadegarzari R, et al. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γGene Expression and Its Association with Oxidative Stress in Patients with Metabolic Syndrome. Chonnam Medical Journal. 2016;52(3):201-206. doi:10.4068/cmj.2016.52.3.201.