Введение
Актуальность проблемы :
- несмотря на то, что заболеваемость болезнью Кушинга составляет лишь 1,2–2,4 на 1млн,
- синдром Кушинга, развивающийся вследствие длительного лечения глюкокортикоидами (ГКС), приводит к аналогичным клиническим проявлениям.
Вне зависимости от генеза гиперкортицизма, избыток ГКС приводит к развитию:
- кушингоидного ожирения,
- нарушению углеводного обмена вплоть до сахарного диабета.
Оба осложнения:
- отягощают течение основного заболевания,
- являются серьезными факторами, обуславливающими высокую смертность среди этих пациентов.
Известно, что ГКС
- изменяют метаболизм жировой ткани:
- активируют дифференцировку адипоцитов,
- стимулируют липолиз и липогенез (в зависимости от локализации жировой клетчатки);
- будучи стероидным гормонами, через рецепторный аппарат приводят к индукции или репрессии ряда генов.
Цели:
- Оценить транскрипционную сигнатуру (профиль транскрибируемых генов) адипоцитов у пациентов с болезнью Кушинга;
- Подтвердить результаты в модели на мышах, получающих ГКС.
Материалы и методы
Исследование было одобрено экспертным советом Университета Здравоохранения Мичигана и комитетом по работе с животными научно-исследовательского центра Университета Теннесси.
Отбор пациентов:
- среди пациентов, ожидающих в течение ближайших 12 месяцев транссфеноидальной аденэктомии по поводу
- болезни Кушинга,
- гормонально неактивной опухоли гипофиза,
- при наличии письменного добровольного согласия.
Критерии исключения:
- Возраст до 18 лет,
- Лечение гормональными препаратами (включая ГКС),
- Наличие воспалительных заболеваний или злокачественных новообразований,
- Сахарный диабет 1 типа,
- Верифицированный гипопитуитаризм.
В бланк пациента включались данные о:
- возрасте,
- поле,
- антропометрических показателях,
- наличии гипертонии и диабета,
- принимаемых препаратах
- результатах анализов крови (тощаковые показатели глюкозы и инсулина)
Биопсия ПЖК
Осуществлялась в ходе операции на гипофизе
- сразу после осуществления наркоза,
- до введения ГКС,
- забирался образец ПЖК, массой примерно 500 мг, из которых:
- ∼100 мг свежей ткани использовалось для ex vivo анализа липолиза колориметрическим методом;
- ∼200 мг сразу замораживались в жидком азоте и хранились при −80 °C для секвенирования РНК и анализа на содержание керамидов.
Анализ липолиза колориметрическим методом
Образцы жировой ткани (25 мг) инкубировали
- предварительно при температуре 37 °C в течение 15 мин в буфере KRBH (Sigma)
- в двух экземплярах в течение 1 часа при температуре 37 °C в 300 мл
В надосадочной жидкости определялась концентрация глицерола с помощью набора (Sigma) согласно инструкции.
Экспериментальная модель синдрома Кушинга: животные, получающие дексаметазон
Всего 24 взрослые (в возрасте 9 недель) мыши C57BL/6 мужского пола, из них:
- 12 — получали 1 мг/кг/день дексаметазона, растворенного в воде;
- 12 — контрольная группа.
Этапы:
- 1 неделя — адаптация;
- 12 недель — эксперимента;
- проба на толерантность к инсулину;
- умерщвление и забор ПЖК.
Мыши обеспечивались:
- водой в неограниченном количестве,
- стандартным кормом для лабораторных животных (rodent diet).
Еженедельно
- измерялись масса и композиционный состав тела животных (с помощью echoMRI 2100);
- взвешивался корм, определялось потребление корма мышью в неделю.
После лечения:
- 16-часовое голодание;
- изофлурановый наркоз;
- умерщвление (смещение шейных позвонков);
- забор и заморозка ПЖК для дальнейших тестов:
- передней брюшной стенки,
- паховой области,
- придатка яичка.
Проба на толерантность к инсулину
- После 12 недель лечения (в возрасте 21 недель),
- После 6-часового голодания, интраперитонеально вводился инсулин (Humulin R, Lilly, Indianapolis, IN, США) в концентрации 1 Ед/г,
- Глюкоза крови определялась с 15-минутны интервалом с помощью глюкометра One Touch Ultra (Lifescan).
Тест для оценки мышечной силы
- На 4, 8 и 12 неделе лечения
- Использовался цифровой динамометр Chatillon (AMETEK, Berwin, PA, США)
- Мыши помещались всеми четырьмя лапами на рабочую поверхность и тянулись за хвост (всего было 10 попыток)
- Мышечная сила оценивалась, как средний за пять попыток максимальный вращающий момент (n)
Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени
- РНК экстрагировалась с помощью набора PureLink РНК mini (Life Technologies);
- Для синтез комплементарной ДНК из 1 мкг РНК использовался набор High Capacity Reverse Transcription (Life Technologies);
- Установление генов, не подверженых воздействию дексаметазона;
- Нормализация уровней экспрессии этих генов (для жировой ткани по- ACTB, для мышечной по — GAPDH)
Таблица1. Использованные для анализа ПЦР секвенированные праймеры
Ген | Прямая последовательность | Обратная последовательность |
Acaca | GCTAAACCAGCACTCCCGAT | GTATCTGAGCTGACGGAGGC |
Aco1 | AACACCAGCAATCCATCCGT | GGTGACCACTCCACTTCCAG |
Acsl1 | GCCTCACTGCCCTTTTCTGA | GCAGAATTCATCTGTGCCATCC |
Acss2 | CGTTCTGTGGAGGAGCCAC | GGCATGCGGTTTTCCAGTAA |
Actb | ATGTGGATCAGCAAGCAGGA | AAGGGTGTAAAACGCAGCTCA |
Agpat2 | CGTGTATGGCCTTCGCTTTG | TCCATGAGACCCATCATGTCC |
Dgat2 | AACACGCCCAAGAAAGGTGG | GTAGTCTCGGAAGTAGCGCC |
Dhcr7 | ATGGCTTCGAAATCCCAGCA | GAACCAGTCCACTTCCCAGG |
Dhcr24 | AGCTCCAGGACATCATCCCT | TACAGCTTGCGTAGCGTCTC |
Fasn | GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT | TGGGTAATCCATAGAGCCCAG |
Fbxo32 | CTTCTCGACTGCCATCCTGG | GTTCTTTTGGGCGATGCCAC |
Gapdh | CACTTGAAGGGTGGAGCCAA | ACCCATCACAAACATGGGGG |
Gpam | AGCAAGTCCTGCGCTATCAT | CTCGTGTGGGTGATTGTGAC |
Gpd1 | GTGAGACGACCATCGGCTG | TTGGGTGTCTGCATCAGGT |
Idh1 | CTCAGAGCTCTCTTGGACCGA | CATCTCCTTGCATCTCCACCA |
Ldhb | AAAGGCTACACCAACTGGGC | GCCGTACATTCCCTTCACCA |
Mdh1 | GGAACCCCAGAGGGAGAGTT | TGGGGAGGCCTTCAACAAAC |
Me1 | GGACCCGCATCTCAACAAG | TCGAAGTCAGAGTTCAGTCGTT |
Psmd1 | TGCCAATCATGGTGGTGACA | ACACATCCTGACGTGCAGTT |
Psmd8 | ACGAGTGGAACCGGAAGAAC | CCGTGGTTGGCAGGAAATTG |
Rplp0 | GAAACTGCTGCCTCACATCCG | GCTGGCACAGTGACCTCACACG |
Rplp13a | GCGGATGAATACCAACCCCT | CCTGGCCTCTCTTGGTCTTG |
Scd1 | CACTCGCCTACACCAACGG | GAACTGGAGATCTCTTGGAGCA |
Trim63 | GAGGGCCATTGACTTTGGGA | TTTACCCTCTGTGGTCACGC |
Определения содержания церамидов
Церамиды – самый простой тип сфинголипидов, на уровне мембраны клетки выполняют структурную и сигнальную функции (регуляция пролиферации, дифференцировки и апоптоза)
- Осуществлялось с помощью жидкостной хромотографии в тройном квадрупольном масс-спектрометре в соответствии с модифицированным протоколом Касумова (2010)
Анализ транскриптома
Транскриптом – совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой; в отличии от генома – может значительно различаться, в клетках разных линий, изменяясь под воздействием средовых факторов.
- Совокупность РНК экстрагировалась из жировой ткани с помощью набора RNEasy (Qiagen);
- Качество экстракта проверялось на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies);
- При помощи набор TruSeq формировалась комплементарная ДНК;
- ДНК секвенировалась в HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA);
- Полученную цепочку сравнивали с геномом человека на TopHat версия 2.0., Bowtie 2 версия 2.1.0 и Samtools версия 0.1.18.;
- Считываемые гены подвергались картированию;
- Для анализа экспрессии генов использовался DESeq2 версия 1.2.10 .
Статистический анализ:
- К клиническим показателям применялись методы описательной статистики;
- Все статистические тесты выполнялись с использованием набора программ R package (версия 3.0.2 (R Core Team 2013)).;
- Нормальность распределения проверялись с помощью критерия Шапиро-Уилка;
- Для данных с ненормальным распределением применялся критерий суммы рангов Уилкоксона;
- При одинаковой дисперсии применялся t-критерий Стьюдетна, в противном случае – критерий Уэлча;
- К показателям продольных антропометрических измерений применялся линейная смешанная модель и χ2-критерия использовался набор lme4 package, версия 1.1-7.;
- Данные признавались статистически значимыми при P/q-значение <0.05;
- Для увеличения статистической мощности из алгоритма DESeq2 исключались гены с высокой дисперсией;
- Упорядоченный перечень генов, сравниваемых у пациентов из основной и контрольной групп, проверялся с помощью GSEA версия 2.0.13. и при необходимости дополнялся из:
- Генной онтологии,
- Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG),
- Набора факторов транскрипции и микроРНК целевых генов (MSigDB version0).
Результаты
Всего было отобрано:
- 5 пациентов с болезнью Кушинга – основная группа;
- 11 пациентов с гормонально неактивной аденомой гипофиза — контроль.
Таблица2. Характеристика пациентов.
Показатель | Основная группа (n=5) | Контроль (n=11) | P-значение |
Рост (см) | 166±4.3 | 169±2.4 | 0.47 |
Вес (кг) | 91±9.1 | 89±6.7 | 0.89 |
ИМТ | 33±3.8 | 30±1.8 | 0.52 |
Окружность талии (см) | 112.4±6.4 | 100.65±4.4 | 0.16 |
Размер опухоли (см) | 0.95±0.3 | 1.96±0.14 | 0.01 |
Возраст (лет) | 39.8±4.5 | 63.4±2.7 | 0.0003 |
Данные представлены в виде: значение±стандартное отклонение
По сравнению с контрольной группой пациенты с болезнью Кушинга:
- Были моложе;
- Имели опухоль меньшего диаметра;
- Незначительно большую массу тела (P=0.47), ИМТ (P=0.27) и окружности талии (P=0.07,);
- Незначительное больший HOMA-IR (в 2,6 раза, P=0.67), в основном за счет повышения уровня инсулина натощак (P=0.30);
- Значимое более высокие значения АЛТ и АСТ
- 3-кратное повышение глицерина в анализе липолиза (P=0.049)
Диабет обнаружен у:
- 3 из 5 пациентов в основной группе;
- Лишь у 1 из 11 в контрольной (P=0.03).
Эти данные подтверждают то, что у пациентов с синдромом Кушинга повышенный риск развития:
- Ожирения
- Нарушения толерантности к глюкозе
- Неалкогольной жировой болезни печени
Экспериментальная модель синдрома Кушинга: животные, получающие дексаметазон
- Потребление пищи между основной и контрольной группами — не различалось
- В основной группе:
- Первоначально — снижение массы (примущественно за счет тощей массы, т.е. мышечной атрофии)
- Начиная с 5 недели – увеличение жировой массы и процента жира (увеличение объема ПЖК подтверждено на вскрытии)
- Несмотря на снижение гликемии натощак, мыши были нечувствительны к инсулин-опосредованному снижению глюкозы
Анализ транскриптома
Между группами пациентов значимо различалась экспрессия 473 генов жировой ткани, из них:
- 92 гена экспрессировались менее интенсивно, в том числе гены, отвечающие за
- синтез белка
- иммунный ответ (развитии воспаления)
- 281 гена более интенсивно, в том числе гены, отвечающие за
- липогенез,
- протеолиз,
- гликолиз.
Обратная отрицательная связь в регуляции сигнальном пути ГКС может осуществляться несколькими способами:
- Через рецепторный аппарат; в основной группе не наблюдалось значимого подавления ЭГ рецепторов к:
- минералкортикоидам (NR3C2)
- глюкокортикоидам (NR3C1)
- Через активацию фермента 11β-HSD1/2, контролирующего локальную концентрацию кортизола в жировой ткани.
- Наблюдалось незначительное понижение уровня ЭГ HSD11B1(на 24%, (Padj)=0.49),
- что приводит к снижению превращения кортизона в кортизол,
- и вероятно свидетельствует о десенсибилизации жировой ткани к кортизолу.
- Через гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось:
- У мышей увеличение ЭГ кортикотропин-релизинг гормона.
Липогенез
Увеличение жировой массы в ПЖК может осуществляться за счет:
- Адипогенеза
- Липогенеза (находит подтверждение).
Активация ЭГ отвечающих за синтез жирных кислот и триглицеридов:
- ключевого фермента липогенеза ацетил-CoA альфа-карбоксилаза (ACACA));
- инициирующего синтез глицеролипидов глицерол-3-фосфат ацилтрансфераза(GPAM).
Увеличение ЭГ, регулирующих биосинтез стероидов:
- Некоторые представители семейства цитохромов P450,
- Стероидные редуктазы (SRD5A1,SRD5A3),
- C1 альдо-кето редуктаза reductase из 1 семейства (AKR1C1),
- 7-дегидрохолестерол редуктаза (DHCR7)
- ГМГ-CoA синтетаза (HMGCS1).
Кроме того, ЭГ
- лептина (LEP) увеличилась в 1,8 раз
- резистина (RETN) увеличилась незначительно
- адипонектина (ADIPOQ) не изменилась
Липолиз
В ПЖК пациентов основной группы ex vivo обнаружено повышение липолиза, за счет:
- Увеличение ЭГ липопротеинлипазы (ЛПЛ) в 1.45 раза (Padj=0.055),
- При этом не обнаружено значимых изменений в уровне транскрипции ни для гормонально чувствительной липазы (LIPE), ни для триглицеридлипазы (PNPLA2)
- Возможно, инсулинорезистентность, вызванная ГКС, приводит к уменьшению подавления липолиза приводит у повышению ЭГ. Однако, исследование проводилось в препаратах в отсутствии инсулина, что говорит в пользу инсулин-независимого активации
- Увеличение перилипина 4 (PLIN4), являющегося покровным белком внутриклеточных жировых капель, в 1.45 раза (Padj=0.056)
Гликолиз
Увеличение ЭГ, отвечающих за метаболизм глюкозы, особенно генов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот:
- Крайне выражено для HK3,FBP1, ALDOC, ENO1, IDH1, ME1 и DLAT.
- Генов, ответственных за синтез гликогена GYS2,UGP2 и GBE1.
Это подтверждает предположение об усиление гликогенеза в печени и жировой ткани при гиперкортицизме.
Катаболизм белков
У мышей наблюдалось уменьшение тощей массы и выраженное снижение мышечной силы, объясняется:
- угнетения синтеза белка,
- усиления протеолиза.
Осуществляется через:
- активацию убиквитин-протеасомную систему,
- активацию пути деградации аминокислот.
Незначительное увеличение ЭГ:
- E3 лигазы (Atrogin-1 и MuRF1);
- мышечных протеаз (катепсины B и D, кальпаин), в том числе протеосомы – крупной протеиназной молекулы, состоящей из нескольких субъединиц (PSMD8) (Padj=0.01);
- катаболизма аминокислот AOX1(на 96%, Padj=0.03), OXCT1 (на 40%, Padj=0.04) and BCAT1 (на 80%, P=0.048);
- лизосом.
Подавление ЭГ:
- рибосом
Инсулиновый путь
Незначительное повышение ЭГ:
- инсулинового пути FOXO1;
- рецепторов к инсулину (INSR);
- субстратов инсулиновых рецепторов IRS1 / IRS2;
- регуляторная субъединица p85 фосвоинозитид-3-киназы (PIK3R1).
В целом в основной группе ЭГ инсулинового пути была значительно выше (Padj=0.006).
ЭГ церамидов и гликозилцерамидов значимо не менялась.
Развитие инсулинорезистентности при гиперкортицизме:
- не объясняется изменениями инсулинового пути или ЭГ церамидов/гликозилцерамидов:
- предположительно связано с увеличением липолиза.
Воспаление
- Подавление иммунной функции осуществляется через несколько сигнальных путей.
- Состояние лейкоцитарного представительства жировой ткани
- зависит от состояния иммунной системы в целом;
- отвечает на изменения в жировой составляющей.
Подавляется ЭГ:
- комплекса гистосовместимости 2 типа (HLA-DPB2,HLA-DRA, HLA-DRB9 и HLADQA1), являющиеся основными антигенами для активации T- клеток;
- интерлейкина 32(IL32);
- гамма-интерферона.
Что подтверждает предположение об угнетении T-клеточного иммунитета при гиперкортицизме.
Моделирующее влияние ожирения на чувствительность к ГКС
Исключительное увеличение ЭГ, определяющих статус ожирения:
- у пациентов без ожирения более значимо FASN,PSMD8 и IDH8;
- у пациентов с ожирением отвечающие за функционирование лизосом, в том числе катепсины (CTSB, CTSD,CTSZ), LAPTM5 и LIPA.
Предположительно, в снижении чувствительности к ГКС, важную роль играют лизосомы, число которых увеличено у пациентов с ожирением.
Обсуждение
Обнаружено, что в условиях хронического гиперкортицизма в жировой и мышечной ткани человека и мыши значительно увеличивается транскрипция генов отвечающих за:
- Гликолиз (ALDOC,ENO1, IDH1, ME1, GALM and GAPDH);
- Протеолиз (PSMD1/14);
- Липогенез (ACACA,FASN, ACSL1, ELOVL5, GPAM and DGAT2).
Что указывает изменения функционирования нескольких сигнальных путей:
- Ускорение метаболизма глюкозы;
- Ускорение цикла трикарбоновых кислот;
- Смещение метаболизма в сторону липогенеза.
Сильные стороны исследования:
- Большая часть результатов, полученных для пациентов из основной группы, была подтверждена в контролируемых условиях на модели синдрома Кушинга на мышах;
- Почти все результаты находят подтверждение в предшествующих исследованиях (незначительные расхождения обусловлены разницей в условиях проведения эксперимента).
Ограничения исследования:
- Маленькая выборка, особенно основная группа (обусловлено редкостью болезни Кушинга);
- Разница в возрасте между основной и контрольной группой (болезнь Кушинга обычно диагностируется раньше);
- При измерении чувствительности к инсулину
- Двое из троих пациентов из основной группы получали гипогликемическую терапию;
- Вероятно, резистентность к инсулину у пациентов и мышей была обусловлена резистентностью мышечной ткани и печени, в то время как адипоциты могли сохранять чувствительность к инсулину.
Заключение
- Изменения в транскрипции генов адипоцитов могут быть причиной развития ряда осложнений болезни Кушинга и сопутствующих заболеваний.
- Для определения, какие именно метаболические эффекты ГКС являются ключевыми при воздействии на жировую ткань, необходимы дальнейшие исследования с использованием животных и клеток с нокаутными или сверхэкспресиированными генами.
Источник:
- Hochberg I, Harvey I, Tran QT, et al. Gene expression changes in subcutaneous adipose tissue due to Cushing’s disease. J Mol Endocrinol. 2015;55(2):81-94. doi:10.1530/JME-15-0119.