+74991102554
info@actendocrinology.ru

Изменение экспрессии генов адипоцитов подкожной жировой клетчатки на фоне гиперкортицизма

Введение

Актуальность проблемы :

  • несмотря на то, что заболеваемость болезнью Кушинга составляет лишь 1,2–2,4 на 1млн,
  • синдром Кушинга, развивающийся вследствие длительного лечения глюкокортикоидами (ГКС), приводит к аналогичным клиническим проявлениям.

Вне зависимости от генеза гиперкортицизма, избыток ГКС приводит к развитию:

  • кушингоидного ожирения,
  • нарушению углеводного обмена вплоть до сахарного диабета.

Cushings-327

Оба осложнения:

  • отягощают течение основного заболевания,
  • являются серьезными факторами, обуславливающими высокую смертность среди этих пациентов.

Известно, что ГКС

  • изменяют метаболизм жировой ткани:
    • активируют дифференцировку адипоцитов,
    • стимулируют липолиз и липогенез (в зависимости от локализации жировой клетчатки);
  • будучи стероидным гормонами, через рецепторный аппарат приводят к индукции или репрессии ряда генов.

Цели:

  1. Оценить транскрипционную сигнатуру (профиль транскрибируемых генов) адипоцитов у пациентов с болезнью Кушинга;
  2. Подтвердить результаты в модели на мышах, получающих ГКС.

Материалы и методы

Исследование было одобрено экспертным советом Университета Здравоохранения Мичигана и комитетом по работе с животными научно-исследовательского центра Университета Теннесси.

Отбор пациентов:

  • среди пациентов, ожидающих в течение ближайших 12 месяцев транссфеноидальной аденэктомии по поводу
    • болезни Кушинга,
    • гормонально неактивной опухоли гипофиза,
  • при наличии письменного добровольного согласия.

Критерии исключения:

  • Возраст до 18 лет,
  • Лечение гормональными препаратами (включая ГКС),
  • Наличие воспалительных заболеваний или злокачественных новообразований,
  • Сахарный диабет 1 типа,
  • Верифицированный гипопитуитаризм.

В бланк пациента включались данные о:

  • возрасте,
  • поле,
  • антропометрических показателях,
  • наличии гипертонии и диабета,
  • принимаемых препаратах
  • результатах анализов крови (тощаковые показатели глюкозы и инсулина)

Биопсия ПЖК

Осуществлялась в ходе операции на гипофизе

  • сразу после осуществления наркоза,
  • до введения ГКС,
  • забирался образец ПЖК, массой примерно 500  мг, из которых:
    • ∼100  мг свежей ткани использовалось для ex vivo анализа липолиза колориметрическим методом;
    • ∼200  мг сразу замораживались в жидком азоте и хранились при −80 °C для секвенирования РНК и анализа на содержание керамидов.

Анализ липолиза колориметрическим методом

Образцы жировой ткани (25 мг) инкубировали

  • предварительно при температуре 37 °C в течение 15 мин в буфере KRBH (Sigma)
  • в двух экземплярах в течение 1  часа при температуре 37 °C в 300 мл

В надосадочной жидкости определялась концентрация глицерола с помощью набора (Sigma) согласно инструкции.

 

Экспериментальная модель синдрома Кушинга: животные, получающие дексаметазон

Maus_DEL_LK

Всего 24 взрослые (в возрасте 9 недель) мыши C57BL/6 мужского пола, из них:

  • 12 — получали 1 мг/кг/день дексаметазона, растворенного в воде;
  • 12 —  контрольная группа.

Этапы:

  1. 1 неделя — адаптация;
  2. 12 недель — эксперимента;
  3. проба на толерантность к инсулину;
  4. умерщвление и забор ПЖК.

Мыши обеспечивались:

  • водой в неограниченном количестве,
  • стандартным кормом для лабораторных животных (rodent diet).

Еженедельно

  • измерялись масса и композиционный состав тела животных (с помощью echoMRI 2100);
  • взвешивался корм, определялось потребление корма мышью в неделю.

После лечения:

  • 16-часовое голодание;
  • изофлурановый наркоз;
  • умерщвление (смещение шейных позвонков);
  •  забор и заморозка ПЖК для дальнейших тестов:
    • передней брюшной стенки,
    • паховой области,
    • придатка яичка.

Проба на толерантность к инсулину

  • После 12 недель лечения (в возрасте 21 недель),
  • После 6-часового голодания, интраперитонеально вводился инсулин (Humulin R, Lilly, Indianapolis, IN, США) в концентрации 1 Ед/г,
  • Глюкоза крови определялась с 15-минутны интервалом с помощью глюкометра One Touch Ultra (Lifescan).

Тест для оценки мышечной силы

  • На 4, 8 и 12 неделе лечения
  • Использовался цифровой динамометр Chatillon (AMETEK, Berwin, PA, США)
  • Мыши помещались всеми четырьмя лапами на рабочую поверхность и тянулись за хвост (всего было 10 попыток)
  • Мышечная сила оценивалась, как средний за пять попыток максимальный вращающий момент (n)

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

  • РНК экстрагировалась с помощью набора PureLink РНК mini (Life Technologies);
  • Для синтез комплементарной ДНК из 1 мкг РНК использовался набор High Capacity Reverse Transcription (Life Technologies);
  • Установление генов, не подверженых воздействию дексаметазона;
  • Нормализация уровней экспрессии этих генов (для жировой ткани по- ACTB, для мышечной по — GAPDH)

Таблица1. Использованные для анализа ПЦР секвенированные праймеры

Ген Прямая последовательность Обратная последовательность
Acaca GCTAAACCAGCACTCCCGAT GTATCTGAGCTGACGGAGGC
Aco1 AACACCAGCAATCCATCCGT GGTGACCACTCCACTTCCAG
Acsl1 GCCTCACTGCCCTTTTCTGA GCAGAATTCATCTGTGCCATCC
Acss2 CGTTCTGTGGAGGAGCCAC GGCATGCGGTTTTCCAGTAA
Actb ATGTGGATCAGCAAGCAGGA AAGGGTGTAAAACGCAGCTCA
Agpat2 CGTGTATGGCCTTCGCTTTG TCCATGAGACCCATCATGTCC
Dgat2 AACACGCCCAAGAAAGGTGG GTAGTCTCGGAAGTAGCGCC
Dhcr7 ATGGCTTCGAAATCCCAGCA GAACCAGTCCACTTCCCAGG
Dhcr24 AGCTCCAGGACATCATCCCT TACAGCTTGCGTAGCGTCTC
Fasn GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT TGGGTAATCCATAGAGCCCAG
Fbxo32 CTTCTCGACTGCCATCCTGG GTTCTTTTGGGCGATGCCAC
Gapdh CACTTGAAGGGTGGAGCCAA ACCCATCACAAACATGGGGG
Gpam AGCAAGTCCTGCGCTATCAT CTCGTGTGGGTGATTGTGAC
Gpd1 GTGAGACGACCATCGGCTG TTGGGTGTCTGCATCAGGT
Idh1 CTCAGAGCTCTCTTGGACCGA CATCTCCTTGCATCTCCACCA
Ldhb AAAGGCTACACCAACTGGGC GCCGTACATTCCCTTCACCA
Mdh1 GGAACCCCAGAGGGAGAGTT TGGGGAGGCCTTCAACAAAC
Me1 GGACCCGCATCTCAACAAG TCGAAGTCAGAGTTCAGTCGTT
Psmd1 TGCCAATCATGGTGGTGACA ACACATCCTGACGTGCAGTT
Psmd8 ACGAGTGGAACCGGAAGAAC CCGTGGTTGGCAGGAAATTG
Rplp0 GAAACTGCTGCCTCACATCCG GCTGGCACAGTGACCTCACACG
Rplp13a GCGGATGAATACCAACCCCT CCTGGCCTCTCTTGGTCTTG
Scd1 CACTCGCCTACACCAACGG GAACTGGAGATCTCTTGGAGCA
Trim63 GAGGGCCATTGACTTTGGGA TTTACCCTCTGTGGTCACGC

Определения содержания церамидов

Церамиды – самый простой тип сфинголипидов, на уровне мембраны клетки выполняют структурную и сигнальную функции (регуляция пролиферации, дифференцировки и апоптоза)

  • Осуществлялось с помощью жидкостной хромотографии в тройном квадрупольном масс-спектрометре в соответствии с модифицированным протоколом Касумова (2010)

Анализ транскриптома

Транскриптом – совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой; в отличии от генома – может значительно различаться, в клетках разных линий, изменяясь под воздействием средовых факторов.

  • Совокупность РНК экстрагировалась из жировой ткани с помощью набора RNEasy (Qiagen);
  • Качество экстракта проверялось на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies);
  • При помощи набор TruSeq формировалась комплементарная ДНК;
  • ДНК секвенировалась в HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA);
  • Полученную цепочку сравнивали с геномом человека на TopHat версия 2.0., Bowtie 2 версия 2.1.0 и Samtools версия 0.1.18.;
  • Считываемые гены подвергались картированию;
  • Для анализа экспрессии генов использовался DESeq2 версия 1.2.10 .

Статистический анализ:

  • К клиническим показателям применялись методы описательной статистики;
  • Все статистические тесты выполнялись с использованием набора программ R package (версия 3.0.2 (R Core Team 2013)).;
  • Нормальность распределения проверялись с помощью критерия Шапиро-Уилка;
  • Для данных с ненормальным распределением применялся критерий суммы рангов Уилкоксона;
  • При одинаковой дисперсии применялся t-критерий Стьюдетна, в противном случае – критерий Уэлча;
  • К показателям продольных антропометрических измерений применялся линейная смешанная модель и χ2-критерия использовался набор lme4 package, версия 1.1-7.;
  • Данные признавались статистически значимыми при P/q-значение <0.05;
  • Для увеличения статистической мощности из алгоритма DESeq2 исключались гены с высокой дисперсией;
  • Упорядоченный перечень генов, сравниваемых у пациентов из основной и контрольной групп, проверялся с помощью GSEA версия 2.0.13. и при необходимости  дополнялся из:
    • Генной онтологии,
    • Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG),
    • Набора факторов транскрипции и микроРНК целевых генов (MSigDB version0).

Результаты

Всего было отобрано:

  • 5 пациентов с болезнью Кушинга – основная группа;
  • 11 пациентов с гормонально неактивной аденомой гипофиза — контроль.

Таблица2. Характеристика пациентов.

Показатель Основная группа (n=5) Контроль (n=11) P-значение
Рост (см) 166±4.3 169±2.4 0.47
Вес (кг) 91±9.1 89±6.7 0.89
ИМТ 33±3.8 30±1.8 0.52
Окружность талии  (см) 112.4±6.4 100.65±4.4 0.16
Размер опухоли (см) 0.95±0.3 1.96±0.14 0.01
Возраст (лет) 39.8±4.5 63.4±2.7 0.0003

Данные представлены в виде: значение±стандартное отклонение

По сравнению с контрольной группой пациенты с болезнью Кушинга:

  • Были моложе;
  • Имели опухоль меньшего диаметра;
  • Незначительно большую массу тела (P=0.47), ИМТ (P=0.27) и окружности талии (P=0.07,);
  • Незначительное больший HOMA-IR (в 2,6 раза, P=0.67), в основном за счет повышения уровня инсулина натощак (P=0.30);
  • Значимое более высокие значения АЛТ и АСТ
  • 3-кратное повышение глицерина в анализе липолиза (P=0.049)

Диабет обнаружен у:

  • 3 из 5 пациентов в основной группе;
  • Лишь у 1 из 11 в контрольной (P=0.03).

Эти данные подтверждают то, что у пациентов с синдромом Кушинга повышенный риск развития:

  • Ожирения
  • Нарушения толерантности к глюкозе
  • Неалкогольной жировой болезни печени

Экспериментальная модель синдрома Кушинга: животные, получающие дексаметазон

  • Потребление пищи между основной и контрольной группами — не различалось
  • В основной группе:
    • Первоначально — снижение массы (примущественно за счет тощей массы, т.е. мышечной атрофии)
    • Начиная с 5 недели – увеличение жировой массы и процента жира (увеличение объема ПЖК подтверждено на вскрытии)
    • Несмотря на снижение гликемии натощак, мыши были нечувствительны к инсулин-опосредованному снижению глюкозы

kartinka-tolstaya-mysh-2525

Анализ транскриптома

Между группами пациентов значимо различалась экспрессия 473 генов жировой ткани, из них:

  • 92 гена экспрессировались менее интенсивно, в том числе гены, отвечающие за
    • синтез белка
    • иммунный ответ (развитии воспаления)
  • 281 гена более интенсивно, в том числе гены, отвечающие за
    • липогенез,
    • протеолиз,
    • гликолиз.

Обратная отрицательная связь в регуляции сигнальном пути ГКС может осуществляться несколькими способами:

  1. Через рецепторный аппарат; в основной группе не наблюдалось значимого подавления ЭГ рецепторов к:
  • минералкортикоидам (NR3C2)
  • глюкокортикоидам (NR3C1)
  1. Через активацию фермента 11β-HSD1/2, контролирующего локальную концентрацию кортизола в жировой ткани.
    • Наблюдалось незначительное понижение уровня ЭГ HSD11B1(на 24%,  (Padj)=0.49),
    • что приводит к снижению превращения кортизона в кортизол,
    • и вероятно свидетельствует о десенсибилизации жировой ткани к кортизолу.
  1. Через гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось:
  • У мышей увеличение ЭГ кортикотропин-релизинг гормона.

Липогенез

Увеличение жировой массы в ПЖК может осуществляться за счет:

  • Адипогенеза
  • Липогенеза (находит подтверждение).

Активация ЭГ отвечающих за синтез жирных кислот и триглицеридов:

  • ключевого фермента липогенеза ацетил-CoA альфа-карбоксилаза (ACACA));
  • инициирующего синтез глицеролипидов глицерол-3-фосфат ацилтрансфераза(GPAM).

Увеличение ЭГ, регулирующих биосинтез стероидов:

  • Некоторые представители семейства цитохромов P450,
  • Стероидные редуктазы (SRD5A1,SRD5A3),
  • C1 альдо-кето редуктаза reductase из 1 семейства (AKR1C1),
  • 7-дегидрохолестерол редуктаза (DHCR7)
  • ГМГ-CoA синтетаза (HMGCS1).

Кроме того, ЭГ

  • лептина (LEP) увеличилась в 1,8 раз
  • резистина (RETN) увеличилась незначительно
  • адипонектина (ADIPOQ) не изменилась

Липолиз

В ПЖК пациентов основной группы ex vivo обнаружено повышение липолиза, за счет:

  • Увеличение ЭГ липопротеинлипазы (ЛПЛ) в 1.45 раза (Padj=0.055),
  • При этом не обнаружено значимых изменений в уровне транскрипции ни для гормонально чувствительной липазы (LIPE), ни для  триглицеридлипазы (PNPLA2)
  • Возможно, инсулинорезистентность, вызванная ГКС, приводит к уменьшению подавления липолиза приводит у повышению ЭГ. Однако, исследование проводилось в препаратах в отсутствии инсулина, что говорит в пользу инсулин-независимого активации
  • Увеличение перилипина 4 (PLIN4), являющегося покровным белком внутриклеточных жировых капель, в 1.45 раза (Padj=0.056)

Гликолиз

Увеличение ЭГ, отвечающих за метаболизм глюкозы, особенно генов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот:

  • Крайне выражено для HK3,FBP1ALDOCENO1IDH1ME1 и DLAT.
  • Генов, ответственных за синтез гликогена GYS2,UGP2 и GBE1.

Это подтверждает предположение об усиление гликогенеза в печени и жировой ткани при гиперкортицизме.

Катаболизм белков

У мышей наблюдалось уменьшение тощей массы и выраженное снижение мышечной силы, объясняется:

  • угнетения синтеза белка,
  • усиления протеолиза.

Осуществляется через:

  • активацию убиквитин-протеасомную систему,
  • активацию пути деградации аминокислот.

Незначительное увеличение ЭГ:

  • E3 лигазы (Atrogin-1 и MuRF1);
  • мышечных протеаз (катепсины B и D, кальпаин), в том числе протеосомы – крупной протеиназной молекулы, состоящей из нескольких субъединиц (PSMD8) (Padj=0.01);
  • катаболизма аминокислот AOX1(на 96%, Padj=0.03), OXCT1 (на 40%, Padj=0.04) and BCAT1 (на 80%, P=0.048);
  • лизосом.

Подавление ЭГ:

  • рибосом

Инсулиновый путь

Незначительное повышение ЭГ:

  • инсулинового пути FOXO1;
  • рецепторов к инсулину (INSR);
  • субстратов инсулиновых рецепторов IRS1 / IRS2;
  • регуляторная субъединица p85 фосвоинозитид-3-киназы (PIK3R1).

В целом в основной группе ЭГ инсулинового пути была значительно выше (Padj=0.006).

ЭГ церамидов и гликозилцерамидов значимо не менялась.

Развитие инсулинорезистентности при гиперкортицизме:

  • не объясняется изменениями инсулинового пути или ЭГ церамидов/гликозилцерамидов:
  • предположительно связано с увеличением липолиза.

Воспаление

  • Подавление иммунной функции осуществляется через несколько сигнальных путей.
  • Состояние лейкоцитарного представительства жировой ткани
    • зависит от состояния иммунной системы в целом;
    • отвечает на изменения в жировой составляющей.

Подавляется ЭГ:

  • комплекса гистосовместимости 2 типа (HLA-DPB2,HLA-DRAHLA-DRB9 и HLADQA1), являющиеся основными антигенами для активации T- клеток;
  •  интерлейкина 32(IL32);
  • гамма-интерферона.

Что подтверждает предположение об угнетении T-клеточного иммунитета при гиперкортицизме.

Моделирующее влияние ожирения на чувствительность к ГКС

Исключительное увеличение ЭГ, определяющих статус ожирения:

  • у пациентов без ожирения более значимо FASN,PSMD8 и IDH8;  
  • у пациентов с ожирением отвечающие за функционирование лизосом, в том числе катепсины (CTSBCTSD,CTSZ), LAPTM5 и LIPA.

Предположительно, в снижении чувствительности к ГКС, важную роль играют лизосомы, число которых увеличено у пациентов с ожирением.

Обсуждение

Обнаружено, что в условиях хронического гиперкортицизма в жировой и мышечной ткани человека  и мыши значительно увеличивается транскрипция генов отвечающих за:

  • Гликолиз (ALDOC,ENO1IDH1ME1GALM and GAPDH);
  • Протеолиз (PSMD1/14);
  • Липогенез (ACACA,FASNACSL1ELOVL5GPAM and DGAT2).

Что указывает изменения функционирования нескольких сигнальных путей:

  • Ускорение метаболизма глюкозы;
  • Ускорение цикла трикарбоновых кислот;
  • Смещение метаболизма в сторону липогенеза.

Сильные стороны исследования:

  • Большая часть результатов, полученных для пациентов из основной группы, была подтверждена в контролируемых условиях на модели синдрома Кушинга на мышах;
  • Почти все результаты находят подтверждение в предшествующих исследованиях (незначительные расхождения обусловлены разницей в условиях проведения эксперимента).

Ограничения исследования:

  • Маленькая выборка, особенно основная группа (обусловлено редкостью болезни Кушинга);
  • Разница в возрасте между основной и контрольной группой (болезнь Кушинга обычно диагностируется раньше);
  • При измерении чувствительности к инсулину
    • Двое из троих пациентов из основной группы получали гипогликемическую терапию;
    • Вероятно, резистентность к инсулину у пациентов и мышей была обусловлена резистентностью мышечной ткани и печени, в то время как адипоциты могли сохранять чувствительность к инсулину.

fat_cells_slider

Заключение

  • Изменения в транскрипции генов адипоцитов могут быть причиной развития ряда осложнений болезни Кушинга и сопутствующих заболеваний.
  • Для определения, какие именно метаболические эффекты ГКС являются ключевыми при воздействии на жировую ткань, необходимы дальнейшие исследования с использованием животных и клеток с нокаутными или сверхэкспресиированными генами.

Источник:

  1. Hochberg I, Harvey I, Tran QT, et al. Gene expression changes in subcutaneous adipose tissue due to Cushing’s disease. J Mol Endocrinol. 2015;55(2):81-94. doi:10.1530/JME-15-0119.

Tags: , , , , , , , , ,

Добавить комментарий